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    三篇15分文章揭秘:當外泌體遇上環狀RNA
    日期:2020年09月03日    來源:


    文章導讀
    外泌體是細胞分泌的大小為30-200nm的盤狀囊泡,它在人體體液中分布**。2013年,科學家通過研究外泌體細胞囊泡調控機制獲得諾貝爾獎,這使外泌體開始被**關注,隨著研究的深入,人們發現外泌體可作為細胞間信息交流的橋梁,在細胞間往來穿梭進行信息傳遞。另外,外泌體與疾病的發生尤其是在腫 瘤中起到十分關鍵的作用,因此,外泌體也成為了研究疾病以及靶向治 療的切入點。
    盡管外泌體的研究十分火熱,但前期研究主要集中在外泌體的信息傳遞以及外泌體中microRNA的作用機制等方面,關于外泌體中環狀RNA的研究仍方興未艾,小編就近日新發表的三篇外泌體環狀RNA高 分文章進行解析,希望能夠使大家對外泌體中的環狀RNA的研究有一些新的認識。

    文章展示
    1.肝ai細胞來源的外泌體circUHRF誘導自然殺傷細胞的衰竭,影響抗PD1治 療的耐藥性
    發表期刊:Molecular Cancer
    影響因子:15.302
    發表時間:2020.6.27
    文章鏈接Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma
    2020年6月27日,Molecular Cancer(IF=15.302)雜志上發表了一篇題為“Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma”的文章,文中對肝ai(HCC)細胞分泌的外泌體中circUHRF1的研究發現,circUHRF1可以通過與miR-449c-5p形成海綿機制從而影響其下游基因TIM-3的表達,結果顯 示抑 制自然殺傷細胞(NK)功能并提高了抗PD1免疫療法的耐藥性。


    (1)circUHRF1在肝ai組織中表達上調
    通過環狀RNA測序數據分析得到UHRF1在肝ai組織中表達上調,并在其病理過程中起重要作用。后通過qPCR技術檢測HCC中的標志基因UHRF1來源的14個circRNA,發現hsa_cic_0048677(circUHRF1)是肝ai組織中表達量**高的環狀RNA。并且在HCC組織中circUHRF1的表達高于非腫 瘤組織。臨床生理表型顯示circUHRF1表達高的患者中腫 瘤體積較大,血液中NK細胞比例較低,微血管浸潤較多。Kaplan-Meier生存分析顯示,circUHRF1高表達患者伴隨臨床預后不良。綜上所述,HCC細胞中circUHRF1表達上調與患者預后不良相關,并表明circUHRF1表達上調可能參與了HCC的進展。


    circUHRF1在肝癌組織中表達上調
    (2)肝ai細胞可以通過外泌體分泌circUHRF1
    作者從六種肝ai細胞系中分離并利用電鏡(TEM)WB鑒定了相應的外泌體。qPCR顯示HCCLM3和SMMC-7721細胞系衍生的外泌體circUHRF1的表達**高。為了研究circUHRF1是否可以由HCC細胞通過外泌體遞送到HCC患者血漿中。進行了qPCR鑒定了血漿外泌體circUHRF1,結果顯示HCC患者血漿外泌體circUHRF1水平較高,腫 瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低,腫 瘤復發患者血漿外泌體circUHRF1水平升高,說明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細胞產生。此外,外泌體circUHRF1水平的升高常伴隨著NK細胞比例降低。上述數據表明,外泌體circUHRF1可能是決定NK細胞相關免疫逃避的關鍵分子。
    肝癌細胞可以通過外泌體分泌circUHRF1
    ( 3)肝ai細胞通過外泌體circUHRF1抑 制NK細胞功能
    為確定HCC細胞衍生的外泌體circUHRF1是否可以誘導NK細胞功能異常,作者將NK細胞與HCCLM3和SMMC-7721細胞進行共培養。結果表明,與SMMC-7721和HCCLM3細胞共培養的NK細胞中分泌IFN-γ和TNF-α受到抑 制且circUHRF1表達的顯 著增強,但這兩種作用可以被外泌體抑 制劑GW4869所阻斷。為進一步研究HCC細胞是通過外泌體circUHRF1介導NK細胞功能障礙,作者利用shRNA敲低了SMMC-7721和HCCLM3 細胞中circUHRF1的表達,qPCR顯示在敲低circUHRF1的肝ai細胞中,外泌體circUHRF1的表達顯 著降低,從而改善NK細胞中IFN-γ和TNF-α的分泌受損。這些結果說明,HCC通過外泌體circUHRF1抑 制NK細胞功能。
    肝癌細胞通過外泌體circUHRF1抑制NK細胞功能
    (4)circUHRF1通過miR-449c-5p相關途徑來抑 制NK細胞功能
    作者利用生物信息學預測了14個miRNA,在NK-92細胞中進行circUHRF1-RIP以及qPCR,結果表明miR-449c-5p是NK-92細胞中一個與circUHRF1相互作用的miRNA。在NK-92細胞中進行抗AGO2抗體的RIP和生物素化miR-449c-5p的RNA pull-down實驗,證明了circUHRF1可以直接與miR-449c-5p結合。此外經雙熒光素酶報告實驗和分別在NK-92細胞中過表達circUHRF1和miR-449c-5p,證明了在NK細胞中circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向。此外單獨過表達miR-449c-5p會顯 著抑 制腫 瘤的活性,但增加circUHRF1表達**抑 制miR-449c-5p的腫 瘤抑 制功能,說明HCC衍生的外泌體circUHRF1通過miR -449c-5p相關途徑抑 制NK細胞功能。
    circUHRF1通過miR-449c-5p相關途徑來抑制NK細胞功能
    (5)circUHRF1通過抑 制miR-449c-5p來上調TIM-3的表達
    作者分析了NK細胞中預測的miR-449c-5p靶基因TIM-3,同樣進行了雙熒光素酶報告實驗,結果顯示miR-449c-5p能直接與靶基因TIM-3的3’UTR區直接結合。超表達miR-449c-5p后TIM-3表達**降低。為了驗證NK細胞中外泌體circUHRF1的持續上調吸附miR-449c-5p,從而導致TIM-3的表達上調造成HCC的免疫逃避這一觀點。作者檢測了miR-449c-5p單獨或與circUHRF1共同轉染的NK-92細胞中TIM-3的表達。結果顯示,miR-449c-5p超表達導致TIM-3 mRNA和蛋白表達水平下降,而circUHRF1逆轉了miR-449c-5p的抑 制作用。在體內同樣證實了circUHRF1通過調控miR-449c-5p/TIM-3軸來阻礙NK細胞的功能。
    circUHRF1通過抑制miR-449c-5p來上調TIM-3的表達
    (6)circUHRF1以NK細胞依賴性方式促進HCC進展
    為了進一步探討circUHRF1在HCC中的作用,使用pLO5-ciR-circUHRF1上調了PLC / PRF / 5細胞中circUHRF1的表達。qPCR結果顯示,在過表達circUHRF1的HCC細胞中,外泌體circUHRF1水平也**上調。此外,使用PLC/PRF/5細胞構建肺轉移的NOD/SCID小鼠模型(注射來自健康供者的NK細胞)。結果表明,在接種過表達circUHRF1細胞的肺轉移小鼠內,血漿外泌體中circUHRF1水平更高,肺部的轉移瘤結節更多及結節內NKG2D陽性細胞更少。說明,circUHRF1以外泌體和NK細胞依賴性的方式促進HCC進展。
    circUHRF1以NK細胞依賴性方式促進HCC進展
    (7)circUHRF1可以提高肝ai對抗PD1治 療的耐藥性
    分析了30例進行肝切除術并接受抗PD1免疫治 療的HCC患者的資料并測定circUHRF1的表達水平,結果表明,PD組的circUHRF1水平明顯高于SD組和PR組。此外,檢測了30例HCC患者組織中NKG2D的表達水平。結果表明,與抗PD1治 療敏感的HCC患者相比,抗PD1治 療耐藥的HCC患者中NKG2D的陽性細胞數明顯減少。為直接評估circUHRF1對抗PD1治 療的影響,通過皮下植入circUHRF1基因敲低的HCCLM3細胞或相應的陰性對照細胞來構建小鼠移植瘤模型。結果表明,植入circUHRF1基因敲低細胞的小鼠對抗PD1治 療敏感,并伴隨總生存率的提高。根據上述研究,過表達circUHRF1可以提高HCC對抗PD1治 療的耐藥性,而靶向circUHRF1可能是恢復HCC對抗PD1治 療敏感性的有效方法。
    circUHRF1可以提高肝癌對抗PD1**的耐藥性
    2. 外泌體circSHKBP1通過調控miR-582-3p/HUR/VEGF過程以及抑 制HSP90降解來促進胃ai發展
    發表期刊:Molecular Cancer
    影響因子:15.302
    發表時間:2020.6.29
    文章鏈接Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation
    2020年6月29日,“Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation”,文中闡述了circSHKBP1能夠在胃ai患者的腫 瘤和血清中高表達,并且可以被外泌體遞送,通過海綿吸附miR-582-3p并抑 制HSP90的降解從而起到促ai作用,為胃ai(GC)的發病機理研究提供了新的理論基礎。
     外泌體circSHKBP1通過調控miR-582-3p/HUR/VEGF過程以及抑制HSP90降解來促進胃癌發展
    (1)circSHKBP1在GC組織中**上調
    作者首先通過外泌體環狀RNA測序在8例GC組織和8例正常組織的樣本***鑒定出119種差異表達的circRNA。qPCR發現circSHKBP1是GC中差異表達很是**的circRNA。設計反式剪切位點引物擴增circSHKBP1并進行Sanger測序RNase R實驗,驗證表明circSHKBP1是高度穩定的環狀RNA。對來自GC患者的152對ai組織和正常組織進行ISH分析發現GC組織的circSHKBP1豐度遠高于正常組織,且circSHKBP1的表達與晚期TNM分期、血管浸潤和預后不良相關。
    (2)血清外泌體的circSHKBP1來源于GC組織
    為了確定是否可以在血清外泌體中檢測到circSHKBP1,作者收集了20對GC組織和健康組織的血清外泌體,通過電鏡(TEM)WB發現,胃ai患者血清外泌體來源的circSHKBP1比健康對照組更豐富。血清外泌體中circSHKBP1水平約為GC患者腫 瘤組織中circSHKBP1水平的6倍。研究胃切除手術前后血清外泌體的circSHKBP1水平,發現切除腫 瘤后外泌體circSHKBP1水平急劇下降,說明GC組織是外泌體circSHKBP1的來源。以上結果表明,circSHKBP1是一種來源于胃ai組織的circRNA,可以被外泌體有效地輸送到循環系統中。此外,circSHKBP1的高表達與晚期TNM分期和GC預后不良相關,使其具有作為GC潛在分子標志物的潛力。
    血清外泌體的circSHKBP1來源于GC組織
    (3)GC來源的外泌體circSHKBP1在體外能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲
    為了探索circSHKBP1是否影響GC細胞的生物學過程,分析了circSHKBP1在4種人GC細胞系(BGC823、HGC27、AGS和MGC803)和正常胃上皮細胞系GES1中的表達水平。結果表明,circSHKBP1在4個GC細胞系中均高表達。此外,來自BGC823細胞培養基的外泌體circSHKBP1在GC細胞系中也存在過表達。隨后,以circSHKBP1反向剪接序列的siRNA來敲低circSHKBP1,用pcDNA3.1-CMV-circRNA載體構建circSHKBP1過表達質粒。CCK8和EdU檢測和Transwell檢測顯示,沉默circSHKBP1**抑 制GC細胞增殖、遷移和侵襲能力而過表達circSHKBP1則相反。此外,作者從轉染了circSHKBP1質粒的BGC823和HGC27細胞培養液中提取外泌體,與未處理的GC細胞共培養。結果表明,外泌體circSHKBP1的過表達也影響了GC細胞的增殖、遷移和侵襲。綜上所述,過circSHKBP1能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲并且隨著circSHKBP1在GC細胞中的表達,更多的circSHKBP1通過外泌體中干擾其他GC細胞的生物學功能。 
    GC來源的外泌體circSHKBP1在體外能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲
    (4)circSHKBP1可通過海綿機制吸附miR-582-3p
    鑒于circRNA海綿吸附miRNA的作用已被**研究,且circSHKBP1在胞質中含量豐富,作者探索了circSHKBP1是否通過作為miRNA的海綿分子來發揮生物學功能。對BGC823細胞中的AGO2進行RIP,結果顯示內源性circSHKBP1特異性地富集于AGO2。使用CircInteractome預測可以與circSHKBP1結合的潛在miRNA分子(miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458)。qPCR、RNA pull-down雙熒光素酶報告實驗證實只有miR-582-3p可以直接與circSHKBP1互作。綜上所述,circSHKBP1可以充當miR-582-3p的海綿分子并降低miR-582-3p的表達。隨后作者將miR-582-3p單獨轉染或與circSHKBP1質粒共轉染到GC細胞中。CCK8和Transwell分析表明,miR-582-3p會抑 制GC細胞的增殖、遷移和侵襲,而過表達circSHKBP1則消除了它對GC細胞生長的抑 制作用,這表明circSHKBP1是通過海綿吸附miR-582-3p來發揮的促ai作用。
    circSHKBP1可通過海綿機制吸附miR-582-3p
    (5)circSHKBP1通過上調HUR來促進VEGF的翻譯
    分析臨床數據發現circSHKBP1高表達組的血管浸潤率**較高。使用生信分析網站找到了miR-582-3p的下游靶標HUR和EIF2S1,它們是VEGF(促進內皮細胞增殖)信號通路的一部分。WB分析顯示,過表達circSHKBP1會促進HUR和VEGF的表達,而對EIF2S1無影響。此外,miR-582-3p模擬物可以降低BGC823細胞中HUR和VEGF的表達。同樣,敲低circSHKBP1下調了HUR和VEGF,隨后導入miR-582-3p抑 制劑可以恢復HUR和VEGF的表達水平。HUR的RIP實驗證實,它可以與VEGF mRNA和miR-582-3p直接結合。檢測GC組織中HUR mRNA的表達水平,發現HUR表達與miR-582-3p表達呈負相關,與circSHKBP1表達呈正相關。結果表明,circSHKBP1可以通過調節HUR來調控VEGF的表達。
    circSHKBP1通過上調HUR來促進VEGF的翻譯
    (6)circSHKBP1直接HSP90相互作用并抑 制其降解
    在HGC27細胞中用circSHKBP1探針的RNA pull-down和蛋白質譜結果顯示兩個差異表達蛋白HSP90β和HSP90α(HSP90的異構體)在過表達circSHKBP1的GC細胞中富集。RIP實驗顯示,circSHKBP1能直接作用于HSP90。使用qPCR和ELISA分別檢測HSP90的mRNA和蛋白水平,結果顯示GC腫 瘤組織中的HSP90 mRNA和蛋白均上調且HSP90蛋白表達與circSHKBP1表達呈正相關。然而,在過表達circSHKBP1中使用CHX抑 制蛋白,HSP90的降解受到明顯抑 制。由于泛素連接酶STUB1可以泛素化HSP90。使用蛋白酶體抑 制劑MG132處理時HSP90的降解速度減慢。結合上述研究,作者認為circSHKBP1和STUB1競爭性結合HSP90,通過IP分析獲得證實。此外,HSP90的抑 制劑NMS-E973在體外削弱了circSHKBP1的促ai作用。這些結果表明,circSHKBP1可以直接與HSP90結合,并抑 制STUB1對HSP90的泛素化,從而促進GC的發展。
    circSHKBP1直接HSP90相互作用并抑制其降解
    (7)circSHKBP1調節體內GC的生成
    作者構建了circSHKBP1沉默株系(LV3-sh1、LV3-sh2)和超表達株系(LV5-circSHKBP1),將相應細胞接種到小鼠體內,發現源自LV3-sh1細胞的腫 瘤明顯小于源自LV3-NC的,表明敲低circSHKBP1會抑 制腫 瘤生長。另外,將轉導LV5-circSHKBP1和LV5-NC的細胞接種到裸鼠體內,并對每組中一半數量的小鼠每周給予兩次VEGF抗體。發現源自LV5-circSHKBP1細胞的腫 瘤比源自LV5-NC細胞的腫 瘤更大且更重。此外,qPCR 鑒定血清外泌體和腫 瘤的circSHKBP1的表達,發現外泌體circSHKBP1依賴于ai組織circSHKBP1的表達,這證實了circSHKBP1可通過外泌體遞送到其他部位,并可在循環系統中檢測,這使其可能成為一種很有潛力的GC分子標志物。
    circSHKBP1調節體內GC的生成
    (8)circSHKBP1調控體內GC的轉移
    為了探索circSHKBP1對體內胃ai轉移的影響,作者將熒光素轉染到上述5個細胞系,然后注入裸鼠體內。LV5-circSHKBP1和LV5-NC組中的一半的小鼠每周接受兩次VEGF抗體處理。結果表明,敲低circSHKBP1可**減少肺轉移灶的數目和大小且ISH顯示,敲低circSHKBP1會導致GC肺轉移灶中的HUR和VEGF染色明顯減少。而過表達circSHKBP1可以加重肺轉移病變和增加HUR和VEGF染色。而VEGF抗體可以抑 制circSHKBP1誘導的ai細胞轉移。
    circSHKBP1調控體內GC的轉移
    3. 外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p- TGF- cm1過程驅動大腸ai的惡化
    發表期刊:Molecular Cancer
    影響因子:15.302
    發表時間:2020.7.27
    文章鏈接Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis
    2020年7月27日,發表于Molecular Cancer(IF=15.302)的“Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis”**揭示了來源于腫 瘤細胞外泌體的circPACRGL在大腸ai增殖和轉移中的作用機制,為深入研究circRNA在大腸ai治 療中的作用機制提供了新的理論依據。
    **細胞外泌體的circPACRGL在大腸癌增殖和轉移中的作用機制
    (1)大腸ai(CRC)來源的外泌體可刺激CRC增殖、遷移和侵襲
    為了探索外泌體在CRC中的作用機制,作者首先從CRC細胞系HCT116和SW480的上清液中分離出ai細胞衍生的外泌體。CCK8、傷口愈合實驗和Transwell assay顯示,過表達外泌體**增強了CRC細胞的增殖、遷移和侵襲。流式細胞儀分析顯示,在過表達外泌體的CRC細胞中,凋亡細胞數目**低于對照細胞,WB結果顯示,CRC衍生的外泌體增加了ai細胞相關的蛋白水平。此外,測試了CRC衍生的外泌體在體內轉移瘤模型中的作用,作者發現外泌體處理**增加了HCT116細胞的轉移。綜上所述,CRC衍生的外泌體可促進CRC增殖、遷移和侵襲。
    大腸癌(CRC)來源的外泌體可刺激CRC增殖、遷移和侵襲
    (2)添加腫 瘤來源的外泌體后,circPACRGL在大腸ai細胞中**上調
    通過外泌體環狀RNA測序分析了HCT116和SW480細胞外泌體(Ex-HCT116和Ex-SW480)的表達譜。Venn顯示circPAGAL(也稱為has_circ_0069313)是兩個Ex組中上調特為**的基因,并通過qPCR證實。qPCR顯示在腫 瘤來源的外泌體刺激下,CRC細胞中circPACRGL的表達**上調,且circPACRGL可能來源于腫 瘤衍生的外泌體。為了研究circPACRGL是否為CRC進展所必需的,作者進行了功能缺失分析,將circPACRGL-siRNA轉染到HCT116和SW480細胞中敲低circPACRGL后,使用腫 瘤來源的外泌體刺激兩種CRC細胞,顯示circPACRGL mRNA表達顯著增加。這些結果表明,circPACRGL主要來自腫 瘤來源的外泌體。
    添加**來源的外泌體后,circPACRGL在大腸癌細胞中**上調
    (3)circPACRGL作為海綿分子結合miR-142-3p和miR-506-3p
    作者使用生物信息學數據庫預測發現circPACRGL同時具有miR-142-3p和miR-506-3p的結合位點,雙熒光素酶報告實驗檢測也證實miR-142-3p和miR-506-3p可與circPACRGL直接結合。此外,在CRC細胞來源的外泌體刺激的HCT116和SW480細胞中,miR-142-3p和miR-506-3p表達均**降低。這些結果表明,circPACRGL可以海綿吸附miR-142-3p和miR-506-3p,并抑 制二者的表達。
    circPACRGL作為海綿分子結合miR-142-3p和miR-506-3p
    (4)miR-142-3p / miR-506-3p均可調節 TGF-β1
    使用生物信息學預測了miR-142-3p和miR-506-3p的下游靶基因TGF-β1。通過雙熒光素酶報告實驗,證實了TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶基因。qPCRWB分析進一步表明,轉染miR-142-3p/miR-506-3p可**降低TGF-β1的mRNA和蛋白水平。為了進一步證實miR-142-3p和miR-506-3p對TGF-β1的調節作用,作者使用miR-142-3p/miR-506-3p 處理CRC衍生的外泌體刺激的CRC細胞,結果顯示導入CRC衍生的外泌體后,CRC細胞中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均**增加,而與miR-142-3p/miR-506-3p共同處理后,TGF-β1表達的促進作用被有效抑 制。綜上所述,TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶標。
    miR-142-3p / miR-506-3p均可調節 TGF-β1
    (5)circPACRGL通過海綿機制吸附miR-142-3p /miR-506-3p進而調控TGF-β1促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲
    根據以上數據,作者推測circPACRGL可能通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1軸來調控CRC細胞增殖、遷移和侵襲。CCK8結果顯示,在CRC衍生的外泌體治 療組(Ex-HCT116)中,CRC細胞增殖明顯高于對照組。敲低circPACRGL**降低了CRC細胞增殖,而miR-142-3p/miR-506-3p抑 制劑處理或過表達TGF-β1后,這種抑 制作用會相應減弱。在細胞凋亡實驗中也觀察到了類似的效果。接下來,劃痕實驗和Transwell分析均顯示CRC衍生的外泌體可以增強CRC細胞的遷移和侵襲能力,而在circPACRGL敲低的細胞中則發生了相反的作用,CRC衍生的外泌體處理可以回補circPACRGL敲低細胞的遷移和侵襲能力。與CCK8和細胞凋亡檢測結果一致,miR-142-3p / miR-506-3p抑 制劑處理或過表達TGF-β1顯著促進了circPACRGL敲低細胞的遷移和侵襲能力。以上結果表明,circPACRGL通過調節miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲。
    circPACRGL通過海綿機制吸附miR-142-3p /miR-506-3p進而調控TGF-β1促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲
    (6)來源于CRC的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程調節N1-N2中性粒細胞的分
    上述研究表明,circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1過程促進大腸ai的發展。作者進一步探討CRC衍生的外泌體circPACRGL是否也可以通過這個軸調節中性粒細胞的N1-N2分化。流式細胞儀檢測結果顯示,CRC衍生的外泌體可以增加N2中性粒細胞的百分比,這與N2標記物CD11b + / Ly6G + / Ly6Clow的上調相一致。相比之下,在circPACRGL敲低的細胞中,N2中性粒細胞的百分比顯著降低,而加入CRC衍生的外泌體后,這種抑 制作用被取消。此外,miR-142-3p/miR-506-3p抑 制劑處理或過表達TGF-β1可以顯 著增加circPACRGL敲低細胞中N1-N2的分化。綜上分析,CRC衍生外泌體的circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程促進N1-N2中性粒細胞的分化。
    來源于CRC的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程調節N1-N2中性粒細胞的分化
    總結
    總體來說,上述三篇研究通過外泌體提取、外泌體鑒定、外泌體環狀RNA測序、qRT-PCR、Sanger測序、RNA pull-down+MS/WB、RIP以及雙熒光素酶報告實驗等方法(云序可提供以上服務),探究外泌體環狀RNA通過海綿機制吸附miRNA進而調控下游疾病相關基因mRNA的表達過程,結果影響ai癥發展進程。這為研究和理解生物體復雜的外泌體環狀RNA調控機制,提供了比較完整的實驗研究思路和方案,具有很強的理論先導性和示范性,也為疾病的調控和靶點提供了重要的理論依據。

    云序外泌體環狀RNA課題技術服務四大模塊
    01 外泌體的提取與鑒定
    1.1 電鏡
    提取血清血漿或細胞上清中的外泌體后進行電鏡觀察。
    1.2 NTA
    檢測外泌體粒徑大小。
    1.3 WB
    驗證外泌體標志蛋白CD9和TSG101等經典外泌體標志物蛋白。
    02 外泌體樣品測序服務
    2.1外泌體全轉錄組測序
    同時檢測外泌體樣品中mRNA、lncRNA和circRNA,獲得**的轉錄組信息。
    2.2外泌體環狀RNA測序
    充分去除外泌體樣品中的線性RNA,特異性地檢測環狀RNA
    2.3 外泌體LncRNA測序
    云序生物提供的LncRNA測序同時檢測外泌體樣品中的LncRNA和mRNA。
    2.4 外泌體mRNA測序
    檢測外泌體中的mRNA表達情況。
    2.5外泌體miRNA測序
    測序外泌體中的miRNA表達情況。
    03篩選驗證
    3.1 qRT-PCR
    對選定目標RNA分子可進行qPCR檢測服務,包括引物設計與表達鑒定。
    3.2 Sanger測序與RNase R酶耐受實驗
    對選定的環狀RNA分子進行反式剪切位點引物設計,擴增后Sanger測序驗證環狀;使用RNase R酶處理環狀RNA分子,驗證環狀RNA分子穩定性。
    04circRNA功能機制研究
    4.1 RIP測序/qPCR
    針對目標蛋白抗體把蛋白-RNA復合物沉淀下來,并對復合物上的RNA進行測序或對目標RNA進行qRCR表達分析。
    4.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
    設計目標RNA生物探針把相應的結合蛋白質與RNA復合物沉淀下來,蛋白質譜檢測或WB檢測與RNA結合的蛋白。設計目標RNA生物探針把相應的結合蛋白質與RNA復合物沉淀下來,qPCR檢測或RNA-seq檢測與RNA結合的RNA。
    4.3雙熒光素酶報告實驗
    雙熒光素酶報告實驗檢測兩個基因之間的互作。
    4.4病 毒液以及siRNA設計
    提供circRNA過表達以及干擾慢病 毒,腺病 毒以及設計siRNA。

    云序微量樣本文章列表
    云序生物作為以高通量測序技術為依托的科研服務公司,擁有豐富的微量樣本測序經驗,為眾多臨床與基礎科研研究者提供了高質量的科研服務,助力客戶發表過眾多外泌體的SCI文章。
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