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    再登Nature Genetics:ecDNA與致ai基因擴增及多種ai癥不良預后相關
    日期:2020年09月04日    來源:
    文章導讀
    研究發現,許多擴增的原ai基因,并不只是位于染色體,而且還能變成游離的染色體外DNA(ecDNA),并出現大量拷貝,而且相當高比例的ecDNA是以環狀DNA分子的形式存在,即eccDNA(染色體外環狀DNA)。由于ecDNA不存在著絲粒,所以在細胞有絲分裂時,無法被均等地分配到兩個母細胞中,這就導致ecDNA的拷貝數會隨著細胞代數的增加而呈現巨大的異質性,從而驅動**演化過程,但是關于ecDNA發生頻率和臨床影響尚不清楚。
    2020年8月17日發表在Nature genetic(IF=27.603)上的一篇題為《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》的文章揭示了ecDNA與致ai基因擴增及多種ai癥的不良預后間的相關性。通過對3212名ai癥患者的全基因組測序數據的分析,研究人員發現ecDNA擴增通常發生在大多數ai癥類型中;與線性DNA相比,ecDNA擴增而引起的ai基因轉錄水平更高,同時染色質的可及性得到增強,能夠更頻繁地與轉錄本融合;攜帶ecDNA的ai癥患者的生存期也明顯短于非ecDNAai基因擴增引起的ai癥患者。此次研究結果表明,基于ecDNA的ai基因擴增在ai癥中普遍存在,并導致許多ai癥類型的患者預后不良。 
    基于ecDNA的ai基因擴增在ai癥中普遍存在,并導致許多ai癥類型的患者預后不良。
    發表期刊:Nature Genetics
    影響因子:27.603
    實驗方法:Circle-Seq,全基因組測序,ATAC-seq
    文章鏈接:《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》

    研究內容
    1.eccDNA擴增**存在于各類ai癥類型中
    ai基因擴增是ai細胞中常見的功能獲得性改變,使**細胞能夠規避體內平衡期間的制約和平衡,從而驅動**生長?;趀cDNA的擴增一直被認為是細胞增加特定基因拷貝數(CN)的一種方法,但它們的發生頻率尚不清楚。全基因組測序(WGS)數據的計算分析和新的環狀DNA文庫富集方法表明,在****系統的 瘤中ecDNA的頻率相對較高。
    研究人員應用AmpliconArchitect基于 WGS腫 瘤組織的數據,與正常組織和血液ai癥基因組圖譜(TCGA) (n = 3731)比較,通過全基因組的泛ai分析(PCAWG)(n = 1291)量化并區分結構區域大于10kb,超過4倍(CN > 4,樣本中位數以上倍數)的擴增子,這些擴增子分為(1)‘環狀’(圖1a),表示存在于染色體外的擴增子;(2)‘BFB’,帶有由‘斷裂-融合-橋’(BFB)機制創建的標記;(3)‘重排列’,指含有來自不同染色體或染色體上相距很遠的DN**段的非環狀擴增子(>1 Mb);(4)‘線性’,表示線性擴增。擴增子狀態是**標本分類的依據。缺乏擴增的樣本標記為“未檢測到局部體細胞CN擴增”(圖1a)。
    測序結果表明,AmpliconArchitect在區分環狀DNA擴增子和線性DNA擴增子方面,WGS和環狀DNA測序(Circle-Seq)方法具有非常高的一致性(圖1b),表明分類的可靠性?;贏mpliconArchitect分類WGS中的 3212個腫 瘤樣本數據集和1810個非**數據集,研究人員從中發現460例(14.3%)**樣本進行1或多個環狀擴增子,證明在ai癥中ecDNA擴增是一種常見的事件。相比之下,環狀擴增在匹配的全血或正常組織樣本中幾乎檢測不到(圖1c)。環狀擴增子頻率的分布與早期ai癥模型的結果一致,表明ecDNA擴增是多種ai癥亞型的明確特征,而非正常細胞。
     腫 瘤與非腫 瘤組織的環型擴增子發生頻率
    圖 1 腫 瘤與非腫 瘤組織的環型擴增子發生頻率
    2.復發性ai基因擴增往往發生在ecDNA上
    579個環狀擴增子的染色體分布與非環狀擴增子的染色體區域相比是非隨機的(圖2a)。在24個常復發的擴增ai基因中,有38%常出現在環狀擴增子上,其中PAX8占11%,CDK4占62%(圖2b)。在至少5個樣本擴增的1,804個ai基因列表中,21.8%的ai基因具有多個環狀結構擴增。對于高度擴增的ai基因(即CN > 8),這一比例進一步增加到53.5%。****系統中ai基因的環狀擴增比非環狀擴增更高。通過進一步觀察,ecDNA結構和ai基因擴增之間的關聯并未延伸到斷點。對于24個頻繁擴增的ai基因,在單位間隔內觀察特定數目斷點的頻率呈指數衰減,這與在ai基因周圍的大多數隨機發生保持一致(圖2c)。這些結果表明,ecDNA是通過隨機過程形成的,對促生長ai基因高拷貝的選擇導致ai基因在**發育過程中快速擴增,而由于其遺傳不均一,保留了瘤內的遺傳異質性。
    環型擴增子的ai基因含量和結構成分
    圖 2 環型擴增子的ai基因含量和結構成分
    3.與線性DNA相比,ecDNA擴增導致的ai基因轉錄水平更高
    環狀ecDNA擴增的轉錄結果發現,在所有擴增子類別中觀察到DNA CN和ai基因表達水平高度明顯相關(圖3a)。然而,DNA CN歸一化后,環狀擴增子上的ai基因表達明顯高于非環狀擴增子。轉錄活性中不依賴于CN的增加現象可能部分是因為增強子劫持機制和ecDNA上染色質可及性提高。為了比較環狀擴增和非環狀區域之間控制基因表達的表觀遺傳機制,采用36個樣本(ATAC-seq)圖譜分析了轉座酶可達染色質的重疊分析。經DNA CN水平校正后,環狀和BFB擴增子的染色質明顯比重排列和線性擴增子更容易接近(圖3b),因此,增加的染色質可及性在ecDNAai基因的失調中扮演了一個重要的角色。與非環狀擴增相比,環狀擴增的轉錄子融合頻率增加了5倍(圖3c)。我們觀察到圍繞環狀擴增子結構的DNA CN,RNA表達和染色質可及性的聚集(圖3d)。

    不同類型擴增子的基因表達和染色質可及性

    圖 3 不同類型擴增子的基因表達和染色質可及性

    4.攜帶ecDNA的ai癥患者生存期更短
    通過臨床數據分析發現,與非環狀或無擴增的**相比,含有ecDNA擴增的腫 瘤患者的5年生存率明顯更差(Fig. 4a),并且環狀擴增子在惡性**如膠質母細胞瘤中更為普遍。文章通過擬合了Cox比例風險模型說明與疾病亞型相關的生存率,該模型在控制了疾病亞型后測試生存率。模型顯示,攜帶圓形擴增子的**患者的危險比明顯更高(圖4b)。這些發現暗示染色體外DNA擴增與惡性**的侵襲性行為有關,可能是通過為**提供額外的途徑來繞過治 療和其他進化瓶頸。

    環型擴增子與不良預后相關

    圖 4 環型擴增子與不良預后相關


    總結

    本文作者通過提供的數據分析,發現環狀ecDNA在ai癥中發揮關鍵作用,環狀ecDNA為實現和維持高拷貝ai基因擴增和多樣性,同時驅動染色質可達性增強和ai基因轉錄升高。這種擴增機制在很大一部分人類ai癥中起作用,并對患者預后產生負面影響,與ai癥譜系無關。結果展示了ecDNA在ai癥中的應用??紤]到ai癥的異質性,可以肯定不同類型的ai癥之間存在ecDNA結構和行為的多樣性。進一步的研究將有助于更好地理解產生包括ecDNA在內的基因組重排的機制,如深入研究跨ai癥的復雜結構變異的模式。本文在ai癥基因組學和廣 泛的患者群體實用性之間建立聯系,發現人類ai癥中ecDNA進行診斷或治 療的潛力。

    本文在ai癥基因組學和廣 泛的患者群體實用性之間建立聯系,發現人類ai癥中ecDNA進行診斷或治 療的潛力。

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    eccDNA測序(別名:Circle-Seq環狀DNA測序是eccDNA檢測利器,可以高通量地對各種物種樣本當中檢測樣品中的所有eccDNA,具有檢出率高﹑準確性好等優點。云序生物eccDNA測序采用多種方法高效地富集和擴增eccDNA,簡述如下:*先,利用離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA,然后利用核酸酶進一步對富集的eccDNA進行消化除去殘余線性DNA。富集純化后,通過滾環擴增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環狀DNA分子。嚴謹的實驗流程,極大地提高了eccDNA的檢出率和檢測靈敏度。通過嚴謹的eccDNA生信流程,實現了對eccDNA準確的識別和詳細的基因注釋,快速找到ai癥、腫 瘤等疾病機理研究和診斷的靶向eccDNA。      
    云序生物eccDNA測序實驗示意圖
    云序生物eccDNA測序實驗示意圖 
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    云序生物是國內較早提供eccDNA測序服務的公司,云序在2018年已啟動了eccDNA測序技術的開發。迄今為止,我們已經完成上千例樣品的eccDNA測序,積累了豐富的項目經驗,樣品類型涵蓋:組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等,物種涵蓋:人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
    云序eccDNA測序數據質控:

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    2.*一提供eccDNA一站式服務的公司
    云序是*一家提供eccDNA檢測和鑒定一站式服務的公司,除了eccDNA測序,云序還可以提供包括eccDNA Outward PCR和Sanger測序在內的一系列eccDNA驗證服務。
    √ 云序產品1:eccDNA測序Circle-Seq
    作用:檢測eccDNA高效和準確的方法。通過柱純化,酶切等手段對eccDNA進行純化富集后,利用NGS測序高通量地檢測和識別樣品中的所有eccDNA。
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    作用:研究全基因組范圍內染色質開放狀態的一種高通量測序技術。ATAC-Seq數據也可用于分析處于染色質開放狀態的部分eccDNA信息。
    √ 云序產品3:eccDNA Outward PCR驗證
    作用:通過核酸外切酶處理和Outward PCR驗證eccDNA的環形結構。
    eccDNA Outward PCR驗證
    √ 云序產品4:eccDNA Sanger測序
    作用:通過金標準的Sanger測序,驗證eccDNA特異性的junction位點。
    eccDNA Sanger測序
    3.專業的生信分析
    云序生物對eccDNA進行專業細致的注釋,提供eccDNA的染色體信息﹑坐標信息﹑長度信息﹑反式剪切位點信息﹑序列信息﹑對應的基因信息﹑基因的GO條目及KEGG信號通路注釋信息等,為后續的研究提供了重要線索和便利。
    云序eccDNA生信示例:
    1)eccDNA表達和差異分析 

    eccDNA表達注釋

    eccDNA表達注釋 (例子)

    2)eccDNA整體統計

    eccDNA整體統計
    3)eccDNA功能預測

    差異eccDNA的GO和KEGG信號通路分析

    差異eccDNA的GO和KEGG信號通路分析

    高質量的數據
    云序生物嚴謹的實驗流程和專業的數據分析保證了高質量的結果,eccDNA測序數據與Sanger驗證結果完美吻合,實測數據示例如下:

    eccDNA測序結果驗證

    eccDNA測序結果驗證

    2020年云序視頻講座五大主題:
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    3、2020年國自然熱點之環狀RNA研究策略及工具
    4、2020年國自然熱點之外泌體系統性研究方案及平臺
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