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    Nature重磅新星——eccDNA的物種發現史
    日期:2020年09月04日    來源:

    文章導讀
    隨著高通量測序技術的發展,人類基因組中的神秘面紗被一層層的揭開。eccDNA(extrachromosomal circular DNAs,eccDNAs)作為染色體外的環狀DNA的研究也隨著國際**學術期刊中《Nature》和《Cell》相繼發表的關于eccDNA在**的發生和發展中具有重要功能的報道成為了基因組學研究中的一個爆點。那么對于eccDNA在不同物種中的研究程度也成了眾多科研工作者關注的內容。小編將帶大家了解一下eccDNA在不同物種中“現身”的歷史。
    眾所周知,eccDNA是染色體外的一種特殊的環狀DNA,從它的出現到人們發現它在**中有巨大作用時,已長達55年,在此期間人們發現環狀DNA是自然界普遍存在的一種DNA分子形式,例如細菌或酵母等微生物的基因組DNA、細菌質粒、線粒體DNA等等都是環狀DNA分子。真核生物中還有一類特殊的環狀DNA分子,它們從正?;蚪M中分離或脫落下來,游離于染色體基因組之外,以特殊的方式參與生理或病理過程。由于它們是在染色體之外**存在的DNA分子,因此統稱為染色體外DNA,又因為是環狀結構,因此稱其為染色體外環狀DNA,簡稱eccDNA。它在很多物種中均存在,包括酵母、線蟲、果蠅、哺乳動物、植物等等。我們將探究一下科研界新星eccDNA在不同物種中的研究歷史。
    文章展示
    1.來自兒童惡性**細胞中的雙微體
    發表期刊:The Lancet
    影響因子:202.731
    發表時間:1965.7.10
    文章鏈接:MINUTE CHROMATIN BODIES IN MALIGNANT TUMOURS OF CHILDHOOD
    1965年David和Catherine等在檢查6例來自人類腫 瘤染色體的過程中,遇到了一個從未發現過的異?,F象:除了腫 瘤細胞中結構完整的染色體組以外,有非常小的雙染色質體的存在。Cox, D.等報道從人的腫 瘤標本細胞中發現的染色體外的DNA分子經常是成對出現的,因此當時稱其為雙微體(double-minutes)。作者首先考慮了雙染色質體是外來起源的可能性。從形態上看,它們中的一些很容易讓人聯想到某些雙球菌,但經過多次探究認為它們并不是來自于細菌的污染,因此,它們的起源可以被認為是染色體來源的,但沒有足夠的證據來確定它們是如何產生的。
    來自兒童惡性腫 瘤細胞中的雙微體來自兒童惡性腫 瘤細胞中的雙微體
    2.小鼠心臟多分布的小環狀DNA重復序列簇的堅定:與年齡研究相關
    發表期刊:Nucleic Acids Research
    影響因子:19.16
    發表時間:1988.4.5
    文章鏈接:Characterization of repetitive sequence families in mouse heart small polydisperse circular DNAs:age-related studies
    作者利用堿性變性-復性、酶切和密度梯度法從1個月、8個月、16個月和24個月C57BL/6小鼠心臟組織中分離出閉合環狀DNA(cccDNA)。電子顯微鏡分析表明,所有這些樣品都含有小的多分布環狀DNA (spcDNAs)。spcDNAs在各個年齡的大小分布相似,但在24個月的小鼠心臟spcDNA樣品中觀察到跨度更大的大小分類和更大的環狀DNA分子。根據spcDNAs的終含量,這些環狀分子在體內的數量的變化似乎并不與年齡相關。此外,[3H]-pBR322恢復研究顯示,未發現可能影響年輕組織和老齡組織spcDNAs產量變化的內源性因素。為了確定spcDNAs中重復序列的數量的變化是否與年齡相關,作者使用B1、B2、IAP、L1和小鼠基因組的序列探測心臟spcDNAs。雜交結果顯示,這些序列在spcDNAs各年齡中的表達差異較大。各年齡組中B2序列表達量較高,Ll序列低。B1-、B2-、IAP-和L1-spcDNAs的數量在小鼠出生后24個月時出現下降。說明這些多分布環狀DNA串聯重復序列的表達與小鼠的不同年齡階段相關。

    小鼠心臟多分布的小環狀DNA重復序列簇的堅定:與年齡研究相關

    小鼠心臟多分布的小環狀DNA重復序列簇的堅定:與年齡研究相關

    3.非洲爪蟾染色體外環狀DNA的形成與端粒DNA相關
    發表期刊:EMBO reports
    影響因子:9.071
    發表時間:2002.10.15
    文章鏈接:Formation of extrachromosomal circles from telomeric DNA in Xenopus laevis

    端粒DNA(包括染色體外DNA)的不穩定性和可塑性通常與端粒酶的缺失和哺乳動物細胞的異常生長有關。文章中作者在早期胚胎中檢測到大量與端粒序列(tel-eccDNA)同源的松弛環,占細胞端粒DNA總含量的10%,并展示了在非洲爪蟾發育過程中染色體外端粒重復序列(tel-eccDNA)的形成。eccDNA是由脊椎動物的端粒重復序列(TTAGGG)組成的雙鏈松弛環。其大小于<2 到>20 kb之間,占早期胚胎總細胞端粒含量的10%。tel-eccDNA的數量在發育后期和成人組織中減少。作者利用一種來自非洲爪蟾卵子的無細胞提取物發現tel - eccDNA可以從精子核的端粒染色體束和裸露的DNA中以一種不依賴復制的方式從頭形成。這些結果表明在非洲爪蟾正常發育過程中的DNA端粒具有不尋常的可塑性。

    非洲爪蟾染色體外環狀DNA的形成與端粒DNA相關

    4.果蠅中串聯重復基因的滾環復制機理
    發表期刊:Nucleic Acids Research
    影響因子:19.16
    發表時間:2005.7.26
    文章鏈接:Evidence for rolling circle replication of tandem genes in Drosophila

    染色體外環DNA (eccDNA)是真核生物基因組可塑性的一個特征。它存在于各種生物體中,包含主要來自重復染色體DNA的序列。作者利用二維凝膠電泳檢測了果蠅eccDNA,發現在果蠅中eccDNA大小從<1 kb到> 20kb,占細胞總重復DNA的10%并存在于果蠅的整個生命周期中。此外作者**報道了果蠅中發生eccDNA滾動循環復制的證據,即在二維凝膠上展示了色譜法富集的特定結構,并在其他體系中作為滾環中間體(RCIs)進行了鑒定。這些RCIs與組蛋白基因同源,它們都以串聯重復序列的形式存在于染色體中?;诖?,作者認為滾環復制(RCR)可能發生在任何eccDNA上,將RCR產物重新整合到基因組中可能為真核生物基因組中串聯重復擴增提供了一種新的機制。相反,從染色體中切除eccDNA可能在控制染色體重復數量和防止其過度膨脹方面發揮重要作用。

    果蠅中串聯重復基因的滾環復制機理

    5.通過形成染色體環狀DNA調控釀酒酵母組蛋白基因的擴增
    發表期刊:Nature
    影響因子:69.504
    發表時間:2006.10.26
    文章鏈接:Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae
    適當的組蛋白水平對轉錄、染色體分離和其他染色質介導的過程**重要。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,組蛋白H2A和H2B由HTA1-HTB1和HTA2-HTB2兩對基因編碼。前期研究表明,當HTA2-HTB2缺失時,HTA1-HTB1在轉錄水平上的表達量有補償性的提高。本文提出,HTA2-HTB2通過一個小的環狀染色體進行擴增。在包含39 kb的II染色體的復制中,包括了HTA2-HTB2、組蛋白H3-H4位點HHT1-HHF1、著絲粒和復制起點。新染色體的形成是由兩側的兩個Ty1逆轉錄轉座子組成的。減數分裂后,這兩個特定Ty1元件的重組在hta1-htb1Δ突變體中具有很高的水平,表明減少的組蛋白H2A、H2B的水平刺激組蛋白基因的擴增。同時也證明了在釀酒酵母中能通過控制組蛋白基因的表達量來保持基因組的完整性。
    通過形成染色體環狀DNA調控釀酒酵母組蛋白基因的擴增
    6.染色體外環狀DNA來源于植物基因組(擬南芥和短毛菊)的串聯重復序列
    發表期刊:The Plant Journal
    影響因子:7.091
    發表時間:2007.12.3  
    文章鏈接:Extrachromosomal circular DNA derived from tandemly repeated genomic sequences in plants
    染色體外環DNA(eccDNA)是真核生物基因組可塑性的一個特征。EccDNA在大小上是異質的,包含的序列主要來自重復的染色體DNA。本文作者通過二維凝膠電泳鑒定報告了eccDNA在小型和大型基因組植物物種均有發生,結果表明eccDNA在擬南芥和短毛菊雙色體細胞中都很容易檢測到,這反映了eccDNA在野生型植物中發生是正?,F象。植物eccDNA的大小從> 2 kb到< 20 kb不等,與其他生物體的大小相似。這些DNA分子相當于這兩個物種中的5S核糖體DNA (rDNA)、非編碼染色體高拷貝串聯重復序列和端粒DNA。在兩個物種中都發現了5S rDNA重復單位的環狀多聚體。這種串聯重復序列的環狀多聚體在動物模型中也被發現,說明在真核生物中eccDNA形成具有共同機制。這一機制可能是通過染色體內同源重組產生的環狀結構。這些結果對基因組可塑性和進化過程的研究具有積極意義。
    染色體外環狀DNA來源于植物基因組(擬南芥和短毛菊)的串聯重復序列
    7.基于染色體外環狀DNA的作物棕櫚莧除草劑抗性基因擴增和傳遞研究
    發表期刊:PNAS
    影響因子:12.779
    發表時間:2018.2.15
    文章鏈接:Extrachromosomal circular DNA-based amplification and transmission of herbicide resistance in crop weed Amaranthus palmeri

    面對各種選擇壓力時,如抗 生素、細胞毒性 藥 物、殺蟲劑、除草劑和其他應激環境條件人們在許多細菌和真核生物中觀察到基因擴增的現象。這些拷貝數增加的基因一般是染色體外元件,通常包含自主復制的染色體外環狀DNA分子(eccDNAs)。棕櫚莧是一種農作物雜草,通過擴增5-烯醇**基草酯-3-磷酸合酶,可以產生對草 甘膦的除草劑抗性(EPSPS)基因。本文報道了在草 甘膦除草劑(GR) 中擴增的EPSPS拷貝以不同構象的eccDNAs的形式存在。eccDNAs在有絲分裂和減數分裂的細胞分裂過程中通過一種未知的與有絲分裂和減數分裂染色體相連的機制被傳遞到體細胞、生殖細胞和子代。作者認為eccDNAs在向子細胞的傳遞過程中的不均一性可以快速產生體細胞變異,擴增孢子體中的傳遞到生殖細胞的EPSPS基因,并通過基因組可塑性和適應性進化調節快速的***抗性。

    基于染色體外環狀DNA的作物棕櫚莧除草劑抗性基因擴增和傳遞研究

    基于染色體外環狀DNA的作物棕櫚莧除草劑抗性基因擴增和傳遞研究

    8.雜草中草 甘膦抗性基因對環境適應性進化的分子機制研究
    發表期刊:New Phytologist
    影響因子:10.323
    發表時間:2019.4.9
    文章鏈接:Molecular mechanisms of adaptive evolution revealed by global selection for glyphosate resistance

    雜草對***的抗性揭示了耐藥機制在進化中的多樣性,包括除草劑在液泡中的富集、細胞的快速死亡反應、除草劑靶向目標EPSPS(5-烯醇**基酯-3-磷酸合酶)中的核苷酸多態性和EPSPS基因拷貝數的增加。對于雜草抗***基因EPSPS基因拷貝數增加的過程中,觀察到兩種不同的分子遺傳機制,串聯重復機制和一個與染色體相連并在減數分裂時傳遞給配子的大的染色體外環狀DNA(eccDNA)。這些不同的機制對抗性性狀的傳遞、適應和遺傳產生了一系列影響,特別是eccDNA,為證明除草劑抗性基因如何進化為植物能適應當代環境脅迫的性狀帶來新的見解。

    雜草中***抗性基因對環境適應性進化的分子機制研究

    9.在尖毛蟲程序化的基因組重排中形成了具有轉錄活性的染色體外環狀DNA
    發表期刊:Nucleic Acids Research
    影響因子:19.16
    發表時間:2019.8.28
    文章鏈接:Programmed genome rearrangements in Oxytricha produce transcriptionally active extrachromosomal circular DNA
    染色體外環DNA (eccDNA)是真核生物基因組不穩定性的驅動因素,也是基因組程序化重排的產物,但其程度尚未在尖毛蟲(一種發育過程中具有復雜的DNA消除和易位的纖毛蟲)中報道。文中作者捕獲了基因組重排中特定的環狀DNA分子,從而深入了解其程序性基因組重排的過程。作者恢復了數千個循環切除的Tc1/marine型轉座元件和高可信度的非重復種質限制基因位點。通過使用環狀DNA深度測序、2D凝膠電泳和反聚合酶鏈反應驗證了它們的環狀拓撲結構。此外,還證明了環狀DNA在尖毛蟲中轉錄,產生重排特異性的長鏈非編碼RNA。數千個eccDNA分子的程序化形成使尖毛蟲成為一個研究核酸拓撲結構的模式生物。這也表明eccDNA參與了程序化基因組重排。
    在尖毛蟲程序化的基因組重排中形成了具有轉錄活性的染色體外環狀DNA
    10.酵母菌老化過程中轉錄誘導的染色體外環狀DNA的形成
    發表期刊:PLOS Biology
    影響因子:9.593
    發表時間:2019.10.31
    文章鏈接:Transcription-induced formation of extrachromosomal DNA during yeast ageing
    染色體外環DNA (eccDNA)允許快速和廣 泛的基因拷貝數變異從而促進適應性進化,且該過程往往與ai癥和衰老的生理病理機制有關。文章中作者證明了在銅處理環境下衰老的酵母中積累了高水平的含有銅抗性基因CUP1的eccDNA。串聯重復的CUP1基因的轉錄導致了含CUP1基因的eccDNA積累。文中開發了一種靈敏的、可定量的eccDNA測序方法,可以顯示銅處理時的CUP1 eccDNA積累情況,且具有精確的位點特異性。Sae2、Mre11和Mus81處理導致DNA雙鏈斷裂(DSBs)并從CUP1位點重新形成eccDNA,全基因組分析表明,其他編碼蛋白的eccDNA在衰老的酵母中具有類似的生物發生途徑。雖然CUP1 eccDNA豐富,但其復制效率不高,在衰老細胞中eccDNA的高拷貝數是由于頻繁的形成eccDNA和eccDNA的不對稱分離而導致的。上述研究表明,年齡相關的遺傳變化隨著轉錄模式的變化而變化,導致基因拷貝數受環境的影響。
    酵母菌老化過程中轉錄誘導的染色體外環狀DNA的形成
    11.來源于染色體的環狀DNA在鴿子的基因組和人類基因組中的呈隨機分布
    發表期刊:Genome Biology and Evolution
    影響因子:4.065
    發表時間:2019.12.20
    文章鏈接:Near-Random Distribution of Chromosome-Derived Circular DNA in the Condensed Genome of Pigeons and the Larger,More Repeat-Rich Human Genome
    來源于染色體的染色體外環狀DNA (eccDNA)在許多真核生物物種中是常見的。然而,基因組的大小、基因組中的重復元件的含量等基因組特征是否會影響eccDNAs的數量仍有待研究。本文以家鴿為模型生物,研究了與人類基因組相比,家鴿基因組重復元件的分布和數量。通過對三種不同年齡、不同飛行行為的鴿子血液和胸部肌肉中eccDNA的測序,發現了3萬個獨特的eccDNA。作者確定了鴿子胸肌中可能存在eccDNA的基因組區域,其中包括參與肌肉發育的基因。此外,作者還發現,盡管eccDNA數目與鴿子的生物學年齡無關,但在一個不會飛的品種(王鴿)中,特異的eccDNAs數量明顯高于家鴿。此外,對來自鴿子和人類骨骼肌的eccDNA進行比較發現,每個人類細胞核中有9-10倍的特異的eccDNAs。從重復元件中提取的eccDNA序列在人類中占基因組的比例為72.4%(預期為52.5%)和而在鴿子中占8.7%(預期為5.5%)。綜上所述,eccDNAs在鴿子中是常見的,并且在不同物種和亞種之間每個細胞核中特異的eccDNA的數量是不同的,同時也表明了重復序列中的eccDNA與基因組中含有的重復元件的比例相關。
    來源于染色體的環狀DNA在鴿子的基因組和人類基因組中的呈隨機分布
    12.eccDNA復制子使金花莧具有抗草 甘膦抗性
    發表期刊:The Plant Cell
    影響因子:12.085
    發表時間:2020.07
    文章鏈接:The EccDNA Replicon: A Heritable, Extranuclear Vehicle That Enables Gene Amplification and Glyphosate Resistance in Amaranthus palmeri
    基因拷貝數變異是生物對環境壓力作出反應的主要機制。這常常導致不平衡的結構變化,作為維持生命的適應能力而存在。然而,人們對于引起基因增殖的潛在機制卻知之甚少。在這里,作者展示了一個對金花莧研究得到的獨特結果,在金花莧中有一個常見的大約400kb的染色體外DNA(eccDNA),其中包含(EPSPS)基因和其他58個具有編碼解 毒、復制、重組、轉位和運輸等功能基因。對草 甘膦脅迫條件下金花莧的基因表達分析顯示,這59個基因中有41個表達了EPSPS的高表達基因,以及轉氨酶、鋅指蛋白和一些未鑒定蛋白的編碼基因。eccDNA復制子的基因組結構是由重復序列的可移動遺傳元件組成的,這些可移動遺傳元件可能對穩定性、DNA復制以及相鄰序列和中間序列的整合至關重要。此外,對籽粒莧(軟莖莧)和水大 麻(硬莖莧)同源基因的比較分析表明,更高層次的染色質相互作用有助于金花莧形成來源于基因組的eccDNA復制子結構。
    eccDNA復制子使金花莧具有抗***抗性
    云序生物eccDNA測序
    eccDNA測序(別名:Circle-Seq環狀DNA測序是eccDNA檢測利器,可以高通量地對各種物種樣本當中檢測樣品中的所有eccDNA,具有檢出率高﹑準確性好等優點。云序生物eccDNA測序采用多種方法高效地富集和擴增eccDNA,簡述如下:*先,利用離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA,然后利用核酸酶進一步對富集的eccDNA進行消化除去殘余線性DNA。富集純化后,通過滾環擴增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環狀DNA分子。嚴謹的實驗流程,極大地提高了eccDNA的檢出率和檢測靈敏度。通過嚴謹的eccDNA生信流程,實現了對eccDNA準確的識別和詳細的基因注釋,快速找到ai癥、**等疾病機理研究和診斷的靶向eccDNA。      
    云序生物eccDNA測序實驗示意圖
    云序生物eccDNA測序實驗示意圖 
    云序生物eccDNA測序優勢
    1. 國內*推eccDNA測序服務
    云序生物是國內較早提供eccDNA測序服務的公司,云序在2018年已啟動了eccDNA測序技術的開發。muqian ,我們已經完成上千例樣品的eccDNA測序,積累了豐富的項目經驗,樣品類型涵蓋:組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等,物種涵蓋:人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
    云序eccDNA測序數據質控:

    云序eccDNA測序數據質控:

    云序eccDNA測序數據質控:

    2.* 一提供eccDNA一站式服務的公司
    云序是*一家提供eccDNA檢測和鑒定一站式服務的公司,除了eccDNA測序,云序還可以提供包括eccDNA Outward PCR和Sanger測序在內的一系列eccDNA驗證服務。
    √ 云序產品1:eccDNA測序Circle-Seq
    作用:檢測eccDNA高效和準確的方法。通過柱純化,酶切等手段對eccDNA進行純化富集后,利用NGS測序高通量地檢測和識別樣品中的所有eccDNA。
    √ 云序產品2:ATAC-Seq
    作用:研究全基因組范圍內染色質開放狀態的一種高通量測序技術。ATAC-Seq數據也可用于分析處于染色質開放狀態的部分eccDNA信息。
    √ 云序產品3:eccDNA Outward PCR驗證
    作用:通過核酸外切酶處理和Outward PCR驗證eccDNA的環形結構。
    eccDNA Outward PCR驗證
    √ 云序產品4:eccDNA Sanger測序
    作用:通過金標準的Sanger測序,驗證eccDNA特異性的junction位點。
    eccDNA Sanger測序
    3.專業的生信分析
    云序生物對eccDNA進行專業細致的注釋,提供eccDNA的染色體信息﹑坐標信息﹑長度信息﹑反式剪切位點信息﹑序列信息﹑對應的基因信息﹑基因的GO條目及KEGG信號通路注釋信息等,為后續的研究提供了重要線索和便利。
    云序eccDNA生信示例:
    1)eccDNA表達和差異分析 

    eccDNA表達注釋

    eccDNA表達注釋 (例子)

    2)eccDNA整體統計

    eccDNA整體統計
    3)eccDNA功能預測

    差異eccDNA的GO和KEGG信號通路分析

    差異eccDNA的GO和KEGG信號通路分析

    高質量的數據
    云序生物嚴謹的實驗流程和專業的數據分析保證了高質量的結果,eccDNA測序數據與Sanger驗證結果**吻合,實測數據示例如下:

    eccDNA測序結果驗證

    eccDNA測序結果驗證

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    1、2020年國自然熱點之eccDNA研究思路解析
    2、2020年國自然熱點之m6A甲基化高分文章思路
    3、2020年國自然熱點之環狀RNA研究策略及工具
    4、2020年國自然熱點之外泌體系統性研究方案及平臺
    5、2020年國自然熱點之新型RNA修飾(m6A、m5C、m7G、ac4C、m1A、2’-O甲基化)研究

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    2020國自然研究熱點—eccDNA的前世今生

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    Nature Genetics 揭示eccDNA新功能—驅動神經母細胞瘤基因組重排


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