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    ac4C榮登Nature:RNA修飾研究大有可為
    日期:2020年10月09日    來源:
    RNA修飾是表觀遺傳學中調控轉錄后基因表達的關鍵過程,目前對m6A RNA修飾的研究已進行的如火如荼,但除了m6A以外仍有多種RNA修飾類型參與調控轉錄后的基因表達,其中包括m1A、m5C、m7G、2’-O-甲基化修飾以及ac4C乙?;揎?,在這些領域的研究中也不斷有高 分文章的出現(如表1)。2020年6月17日,美國國立衛生研究院的Schraga Schwartz研究團隊在《Nature》上發表了關于ac4C的研究成果,發現定量交叉進化圖譜揭示了乙?;揎椩赗NA中的動態變化。今 天我們將著重介紹該項研究以及新發表在《Cell Host &Microbe》上的關于ac4C乙?;揎椀奈恼?,從而帶大家把握這一領域的新進展。
    近期RNA修飾文章列表
    表1:近期RNA修飾文章列表

    文章展示
    ac4C——定量交叉進化圖譜揭示乙?;揎椩赗NA中的動態變化
    發表期刊:Nature
    影響因子:69.504
    發表時間:2020.06.17
    實驗方法:Nucleotide-resolution ac4C sequencing
    文章鏈接:Dynamic RNA acetylation revealed by quantitative cross-evolutionary mapping
    ac4C是一種古老且高度保守的RNA修飾,存在于tRNA和rRNA上,近期在真核生物mRNA也有相應的研究。然而胞苷乙?;姆植?、動力學和功能還有待進一步闡明。2020年6月17日,美國國立衛生研究院的研究團隊在《Nature》發表了題為“Dynamic RNA acetylation revealed by quantitative cross-evolutionary mapping .”的研究成果,文章中使用N4-乙酰胞苷(ac4C)-seq,這種化學基因組學方法在單核苷酸分辨率下對ac4C進行全轉錄組范圍的定量。揭示了ac4C乙?;芯康男逻M展,為闡明這種修飾在生物學和疾病中的作用提供了技術基礎和理論依據。
    (1) ac4C單核苷酸分辨率測序

    為了定量研究轉錄組中的胞苷乙?;?,作者開發了一種能夠靈敏檢測ac4C的化學方法在單核苷酸分辨率上對ac4C進行全轉錄組范圍的定量。在前面研究的基礎上,作者發現ac4C和氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)在酸性條件下反應形成還原的N4-乙酰四氫胞苷。與ac4C相比,這種核酸堿基結構的改變導致逆轉錄時錯配形成其他脫氧核苷三磷酸(dNTPs),且可通過cDNA測序檢測出來。與之前的化學反應相比,該反應顯示出更快的動力學,并導致已知ac4C的錯配摻入到rRNA中。關鍵的是,ac4C在分析前用溫和的堿水解(化學法脫乙?;?修飾時,未觀察到相應的突變。將這些化學反應與二代測序相結合,促成了ac4C-seq的發展,形成了一種能夠對ac4C在單核苷酸分辨率上進行全轉錄組定量分析的方法。本文中作者報道了N4-乙酰胞苷測序ac4C-seq這種用化學基因組方法在單核苷酸分辨率上對ac4C進行全轉錄組定量的應用。

    ac4C-seq流程的示意圖

    圖例1:ac4C-seq流程的示意圖

    (2) 古細菌RNA中檢測到ac4C修飾的空前水平
    作者利用液相色譜-質譜聯用(LC-MS)對古生超嗜熱菌的總RNA的交叉進化分析顯示ac4C濃度很高?;诖?,作者應用了ac4C-seq定量繪制了在85℃的生長溫度下培養的柯達卡蘭的胞苷乙?;瘓D,發現ac4C的修飾分布于rRNA、tRNA、非編碼(nc) RNA和mRNA并達到了前所未有的水平。為了了解RNA乙?;欠袷枪偶毦鷺O端微生物的共同特征,作者使用了ac4C-seq分析了糠秕熱球菌和熱球菌中的RNA乙?;揎椝?,結果表明ac4C在熱球菌的每個群體中廣 泛存在且在數百個不同的位點發生修飾。此外也驗證了在古細菌熱球菌中ac4C不僅廣 泛存在,而且ac4C發生的的位置也高度保守。這些研究確定了古生序熱球菌中普遍存在的RNA乙?;捌湔{控機制。

    ac4C在不同古細菌物種中的ac4C修飾水平

    圖例2:ac4C在不同古細菌物種中的ac4C修飾水平

    (3)古細菌RNA乙?;膭討B變化
    為了研究ac4C是如何被環境影響,作者使用ac4C-seq鑒定了在55-95℃的環境下培養的科柯達卡蘭菌種乙?;揎椝?。結果發現,ac4C在溫度升高時被明顯誘導,而缺乏乙酰轉移酶的古細菌菌株表現出溫度依賴的生長缺陷。此外,冷凍電子顯微鏡觀察野生型和缺乏乙酰轉移酶的古細菌核糖體的結果也為ac4C的溫度依賴性分布及其潛在的熱適應作用提供了結構上的證據。作者的研究也定量地顯示了ac4C修飾的整體水平,為闡明這種修飾在生物學和疾病中的作用提供了技術和概念基礎。

    不同溫度處理古細菌時ac4C修飾水平的動態變化

    圖例3:不同溫度處理古細菌時ac4C修飾水平的動態變化

    ac4C——胞苷殘基乙?;ㄟ^增加病 毒RNA的穩定性促進HIV-1基因的表達
    發表期刊:Cell Host &Microbe
    影響因子:31.316
    發表時間:2020.08.12  
    實驗方法:ac4C RNA乙?;瘻y序
    文章鏈接:Acetylation of Cytidine Residues Boosts HIV-1 Gene Expression by Increasing Viral RNA Stability
    表轉錄組RNA修飾,包括腺嘌呤和胞苷殘基的甲基化,被認為是細胞和病 毒mRNA功能的關鍵調節因子。此外,近期有報道稱ac4C可以增加細胞mRNA的翻譯和穩定性。2020年8月12日,杜克大學醫學中心Bryan團隊與北卡羅來納大學Ronald團隊在《Cell Host & Microbe》上發表了ac4C在HIV-1病 毒感 染中的重要作用的研究,本文中作者認為ac4C以及N -乙酰轉移酶10 (NAT10)會被人類免疫缺陷病 毒1 (HIV-1)破壞以增加病 毒基因表達。HIV-1轉錄本能在多個離散位點被ac4C修飾,這些ac4C位點的沉默突變導致HIV-1基因表達下降。同樣,NAT10缺失導致的病 毒轉錄本ac4C缺失通過降低病 毒RNA的穩定性抑 制了HIV-1的復制。有趣的是,NAT10抑 制劑在濃度對細胞活力沒有影響的情況下,可以抑 制HIV-1的復制,因此添加ac4C修飾將成為抗病 毒藥物開發的潛在方向。該研究為HIV的治 療提供了潛在的新靶點,也為深入了解表觀轉錄組提供了方法學的指導。
    NAT10 對HIV-1病 毒的ac4C修飾影響mRNA表達
    圖例4:NAT10 對HIV-1病 毒的ac4C修飾影響mRNA表達
    (1)HIV-1上依賴于NAT10的ac4C修飾
    作者首先使用ac4C -seq分析了HIV-1轉錄本和來自CEM細胞和初級CD4+ T細胞RNA中的乙?;揎椝?,發現ac4C位點同時存在于病 毒和細胞RNA上影響mRNA穩定性,因此研究者通過分析HIV表達來間接反映ac4C修飾對病 毒RNA的影響。.然后作者使用CRISPR-Cas基因編輯敲除了ac4C轉移酶NAT10,在NAT10敲除細胞中可以明顯觀察到病 毒Gag結構基因、病 毒RNA表達量下調,熒光素酶也具有相似的實驗結果。此外,作者也利用NAT10的抑 制劑Remodelin在正常細胞中重復了這一過程,并且發現添加了抑 制劑能夠降低70%的HIV復制,而對NAT10細胞病 毒復制不起作用,因此NAT10可能是HIV的重要輔因子。

    依賴于NAT10的ac4C沉積在HIV-1 RNA的多個位置

    圖例5:依賴于NAT10的ac4C沉積在HIV-1 RNA的多個位置

    (2)NAT10對HIV-1轉錄本表達的影響
    為了進一步研究依賴于NAT10的ac4C修飾在HIV感 染中的作用,作者進行了NAT10的過表達/功能缺失實驗,結果發現NAT10過表達細胞中HIV-1的轉錄本明顯高于其他組。為了研究NAT10是如何調節HIV復制的,作者進行了一個單周期使用WT或nat10突變株進行HIV-1復制實驗并測量HIV-1復制周期中不同步驟的效率。結果發現,nat10突變株中表達減少約70%,表明NAT10的影響主要在RNA水平。此外通過脈沖追蹤、放線菌素D抑 制轉錄發現NAT10/ac4C實際是通過影響HIV-1轉錄本穩定性,來調節基因的表達。

    NAT10敲除影響對HIV-1轉錄本穩定性

    圖例6:NAT10敲除影響對HIV-1轉錄本穩定性

    (3)ac4C修飾對HIV的影響
    之前的研究發現ac4C除了影響mRNA穩定性,還可以提高翻譯效率從而提高細胞內mRNA的表達。為了確定是否只有CDS中存在的ac4C位點才會影響cis中的mRNA功能。作者將病 毒的env基因區域多個ac4C修飾保守位點中的C突變為U,并轉染CD4陰性293T細胞,檢測了HIV-1中Gag蛋白的表達,并發現其表達下調。說明突變了ac4C修飾位點會抑 制HIV-1中Gag蛋白的表達。

    ac4C位點的沉默突變降低了病 毒Gag的表達

    圖例7:ac4C位點的沉默突變降低了病 毒Gag的表達


    云序生物ac4C修飾研究五大模塊
    01 檢測整體ac4C RNA修飾水平
     LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
    精 準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
    02 ac4C RNA修飾測序
    ac4C RNA修飾測序(ac4C-seq)
    對ac4C RNA乙?;?,目前當下 流行的檢測手段為ac4C-Seq技術,適用于ac4C RNA乙?;V研究,快速篩選ac4C RNA乙?;谢?。
    03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
     ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
    尋找上游直接調控ac4C RNA乙?;囊阴^D移酶。
    04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
     acRIP-qPCR
    云序提供各類不同修飾的acRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
    05機制互作研究
    5.1 RIP-seq/qPCR
    篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
    5.2 RNA pull down -MS/WB
    篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
    5.3 雙熒光素酶實驗
    驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
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