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    1區,IF=27|借力m6A甲基化修飾,探索腎細胞*耐藥性機制研究
    日期:2022年05月30日    來源:
    舒尼替尼耐藥性可分為原發性和繼發性耐藥性。雖然過往研究表明了導致舒尼替尼耐藥性的幾個潛在因素,但其在腎細胞*(RCC)中的確切機制尚不清楚。2022年5月10日,浙江大學的研究者們在Molecular Cancer雜志上發表了文章“N6-methyladenosine-modifed TRAF1 promotes sunitinib resistance by regulating apoptosis and angiogenesis in a METTL14-dependent manner in renal cell carcinoma”。本文發現在RCC中,TRAF1的過表達通過一種METTL14依賴性方式,調節凋亡和血管生成途徑,從而促進舒尼替尼耐藥性,而靶向TRAF1可能是舒尼替尼**患者的一種新型藥物干預方式。本文當中涉及到的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、比色法檢測整體RNA修飾水平、m6A RNA修飾相關酶PCR芯片、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR等,云序生物均可提供技術服務。

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    發表期刊:Molecular Cancer
    影響因子:27.401
    發表時間:2022年5月10日
    研究方法m6A MeRIP-seq、RNA-seq、比色法檢測整體RNA修飾水平、m6A RNA飾相關酶PCR芯片、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、雙熒光素酶實驗
    文章鏈接N6-methyladenosine-modified TRAF1 promotes sunitinib resistance by regulating apoptosis and angiogenesis in a METTL14-dependent manner in renal cell carcinoma


    技術路線


    技術路線.png


    研究內容

    01  建立耐舒尼替尼的RCC細胞系和細胞衍生的異種移植模型
    為了表征在體外和體內RCC中的RCC舒尼替尼耐藥性,研究者們通過長期暴露于增加濃度的舒尼替尼,建立了兩個RCC耐舒尼替尼的RCC細胞系(78R和OSR),并通過舒尼替尼口服**建立了耐藥細胞源性異種移植物(CDX-R)模型(圖1.A)。與相應的親本細胞(78S和OSS)相比,78R和OSR細胞對舒尼替尼表現出較差的反應,如IC50增加,集落形成能力增加,舒尼替尼**下細胞凋亡減少和血管生成增加(圖1.B-F)。為了建立細胞來源的異種移植模型,作者將786-O細胞植入裸鼠體內,并在體內三次傳代期間用舒尼替尼**小鼠。為了驗證傳代3異種移植物(CDX-R)的耐藥性,作者將CDX-R和CDX-S**植入裸鼠體內。結果表明,CDX-R**對舒尼替尼**的敏感性低于CDX-S**,如KI67,CD31和CD10水平升高所表明的那樣(圖1.G-J)。
    圖1. 舒尼替尼耐藥模型的建立和驗證
    圖1. 舒尼替尼耐藥模型的建立和驗證

    02  TRAF1 在耐舒尼替尼 RCC 中的表達水平升高
    使用樹對細胞和CDX樣品進行RNA-seq分析,以研究與RCC中舒尼替尼耐藥性相關的的關鍵基因(圖2.A)。共鑒定了196個不同表達的基因,基因本體(GO)富集分析表明,血管生成和凋亡途徑可能對舒尼替尼耐藥性有影響(圖2.B-C)。在舒尼替尼抗性細胞和CDX-R模型中,TRAF1的表達在RNA和蛋白質水平上均顯著上調(圖2.D-G)。通過對CDX樣品進行IHC染色也觀察到相同的結果(圖2.H-I)。與這些發現一致,在對舒尼替尼反應較差的臨床患者中,TRAF1陽性細胞的頻率更高,染色強度更強(圖2.J-K)。重要的是,TRAF1表達較高的患者表現出較差的總生存期(圖2.L)。以上這些數據表明,TRAF1對舒尼替尼耐藥性具有潛在重要性。

    圖2. 舒尼替尼耐藥RCC中TRAF1表達水平升高
    圖2. 舒尼替尼耐藥RCC中TRAF1表達水平升高

    03  TRAF1對于促進舒尼替尼耐藥性至關重要
     在TRAF1敲降的RCC舒尼替尼耐藥細胞系中,舒尼替尼耐藥性**降低,而在TRAF1過表達細胞中,耐藥性增加(圖3.A-B)。同時,在菌落形成(圖3.C-D)和EdU測定(圖3.E-F)中觀察到類似的結果,表明TRAF1在RCC的舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用。此外,流式細胞術分析進一步顯示,TRAF1敲降時,舒尼替尼耐藥細胞凋亡增加(圖3.G),而TRAF1過表達時,舒尼替尼敏感細胞凋亡減少(圖3.H)。
    圖3. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用
    圖3. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用

    此外,管形成測定的結果表明,TRAF1過表達顯著增強了血管生成(圖4.A-B),并且TRAF1表達的減少抑制了血管生成(圖4.C-D)。我們發現TRAF1的相對RNA表達水平與TCGA數據庫中幾個下游基因(mTOR,VEGFA,RELA和PARP)的表達水平之間存在正相關關系,表明TRAF1與這些基因之間存在潛在關聯(圖4.E)。然后使用Western Blot分析進一步研究參與舒尼替尼耐藥性的特定下游蛋白質,顯示TRAF1過表達****AKT/mTOR/HIF1a/VEGFA途徑(圖4.F-G)。上述結果表明,TRAF1對于維持舒尼替尼耐藥性至關重要,沉默TRAF1可通過抑制血管生成和誘導**細胞凋亡來增加舒尼替尼的效率。

    圖4. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用
    圖4. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用

    04  TRAF1受m6A RNA甲基化調節
    先前的研究表明,m6A是RNA中*豐富的堿基修飾,可以調節各種*癥中基因的表達。作者假設TRAF1的上調表達可能通過m6A修飾進行調節。首先,通過使用比色法檢測整體RNA修飾水平,作者發現與親本細胞系或CDX-S樣品相比,舒尼替尼耐藥細胞系和CDX-R樣品中的m6A水平相應**上調(圖5.A-C)。此外,MeRIP-qPCR測定顯示,與野生型細胞相比,在舒尼替尼耐藥細胞中,TRAF1 mRNA中的m6A水平上調(圖5.D-E)。為了進一步證實假設,作者測量了RCC細胞系中m6A RNA修飾相關酶,發現METTL14在舒尼替尼耐藥細胞系中**上調(圖5.F)。為了進一步表征METTL14的表達,作者隨后檢測了其在CDX模型和臨床患者樣本中的表達,結果表明舒尼替尼耐藥組織中METTL14表達顯著增加(圖 5.G-H)。此外,在RNA和蛋白質水平上,METTL14和TRAF1表達之間存在正相關關系(圖5.I-K)。我們之前的m6A測序數據顯示,在METTL14敲低細胞系中,TRAF1 mRNA轉錄本中的m6A水平隨著TRAF1的表達而降低(圖5J)。同時,m6A MeRIP-seq數據顯示,在METTL14敲降細胞系中,TRAF1 mRNA轉錄本中的m6A水平隨著TRAF1的表達而降低(圖5.J)。與此結果一致,MeRIP-qPCR測定證實,當METTL14沉默或過表達時,TRAF1中的m6A水平相應降低或增加(圖5.M-N)。綜上所述,METTL14介導TRAF1 mRNA的m6A甲基化,正向調節舒尼替尼耐藥RCC細胞中的TRAF1表達。
    圖5. TRAF1受m6A RNA甲基化調節
    圖5. TRAF1受m6A RNA甲基化調節

    05  METTL14依賴m6A-IGF2BP2調節TRAF1的mRNA穩定性
    越來越多的證據表明,mRNA轉錄本上的m6A峰可以影響mRNA的穩定性。作者發現,與78S細胞相比,78R細胞中TRAF1轉錄本的半衰期增加(圖6.A)。為了探討METTL14是否通過調節其mRNA穩定性來調節TRAF1表達,作者用轉錄抑制劑放線菌素D(Act D)處理細胞,以測量調節METTL14表達時TRAF1轉錄本的半衰期。結果顯示,METTL14的過表達導致TRAF1轉錄本的半衰期**增加(圖6.B),而METTL14的敲降導致TRAF1轉錄本的半衰期**降低(圖6.C)。為了進一步驗證METTL14對TRAF1的調控取決于其mRNA轉錄本的甲基化這一假設,作者構建了具有TRAF1的3'UTR序列和相應突變體(Mut-3'UTR)序列的熒光素酶報告質粒(圖6.D)。雙熒光素酶實驗結果表明,WT(但未發生突變)METTL14**增強了TRAF1 3'UTR報告基因的表達(圖6.E)。此外,野生型METTL14和突變的METTL14都不能影響mut-3'UTR的熒光素酶活性,這表明了RNA穩定性的m6A依賴性調節(圖6.E-F)。
     
    為了鑒定參與TRAF1調控的reader蛋白,作者設計了靶向已報道的可增強RNA穩定性的reader的小干擾RNA,結果顯示IGF2BP2**影響了TRAF1的表達(圖6.G)。此外,RIP-qPCR顯示IGF2BP2和TRAF1 mRNA之間的直接相互作用(圖6.H)。同時,IGF2BP2和TRAF1轉錄本之間的直接相互作用在舒尼替尼耐藥細胞系中更強(圖6.I),而在調節METTL14表達后,此相互作用**受到影響(圖6.J-K)。TRAF1 mRNA穩定性在抑制IGF2BP2的細胞中受損(圖 6.L)??傊?,這些發現表明METTL14介導的m6A修飾以IGF2BP2依賴性方式增強TRAF1 mRNA穩定性。

    圖6. METTL14 調節 TRAF1 的 mRNA 穩定性
    圖6. METTL14 調節 TRAF1 的 mRNA 穩定性

    06  TRAF1依賴METTL14維持舒尼替尼耐藥性
    基于上述結果,作者假設TRAF1是METTL14在舒尼替尼耐藥中的功能靶標。為了驗證這一假設,作者進行了一系列挽救(rescue)實驗。CCK-8(圖7.A-B),菌落形成(圖7.C-D)和管的形成(圖7.E-F)測定結果顯示,METTL14過表達的78R細胞對細胞凋亡和血管生成有**抑制作用,而TRAF1的敲降降低了METTL14過表達對細胞凋亡和血管生成的增**應。此外,在METTL14敲降細胞中觀察到細胞凋亡和血管生成的顯著增強,而TRAF1的過表達恢復了METTL14敲降產生的的抗凋亡和血管生成效應。Western Blot分析進一步證實,TRAF1通過以METTL14依賴性方式,調節凋亡和血管生成途徑來促進舒尼替尼耐藥性(圖7.G-H)。
    圖7.TRAF1依賴METTL14維持舒尼替尼耐藥性
    圖7.TRAF1依賴METTL14維持舒尼替尼耐藥性

    07  在體內靶向TRAF1抑制RCC中的舒尼替尼耐藥性
    為了進一步證明體外研究結果并探索其潛在的臨床價值,作者采用了體內舒尼替尼耐藥模型(圖8.A)。在耐舒尼替尼的CDX小鼠的皮下植入部位周圍局部注射sh-TRAF1的AAV可以**恢復RCC細胞對舒尼替尼**的敏感性。相比之下,在CDX-S模型中,局部注射OE-TRAF1的AAV促進了舒尼替尼耐藥性(圖8.B-D)。與體外結果一致,IHC染色顯示Ki67,CD31和CD105在sh-TRAF1處理的小鼠中的表達降低,表明sh-TRAF1處理的小鼠的抗凋亡和血管生成能力降低(圖8.E)。此外,TRAF1高表達有助于在舒尼替尼耐藥細胞中**下游抗凋亡和血管生成途徑(圖8.F)。在不久的將來,靶向TRAF1可能是舒尼替尼**患者的一種新型藥物干預。
    圖8. 體內靶向TRAF1延緩舒尼替尼
    圖8. 體內靶向TRAF1延緩舒尼替尼


    小  結
    本文章利用RNA-seq發現TRAF1在舒尼替尼耐藥細胞、CDX-R模型和臨床患者中的表達**增加。而TRAF1水平升高對于通過**抗凋亡和血管生成途徑維持舒尼替尼耐藥性至關重要。耐舒尼替尼RCC中TRAF1水平的增加是由于其mRNA穩定性的增加,m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR顯示這是由TRAF1中m6A修飾介導的。此外,作者證實了METTL14依賴m6A-IGF2BP2調節TRAF1的mRNA穩定性,進而調節凋亡和血管生成途徑來促進舒尼替尼耐藥性。該研究結果提供了舒尼替尼耐藥的新機制,并表明靶向TRAF1及其途徑可能是舒尼替尼**患者的一種新型藥物干預。


    云序生物m6A修飾研究五大模塊
    01 m6A RNA修飾測序
    m6A RNA修飾測序(m6A-meRIP-seq)
    對m6A RNA甲基化,目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術,適用于m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:
    • m6A 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
    • m6A  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
    • m6A  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
    • m6A  mRNA測序
    • m6A  miRNA測序
    02 檢測整體m6A RNA修飾水平
    LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
    **高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
    比色法檢測整體RNA修飾水平
    快速檢測m6A整體甲基化水平
    03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
    m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
    尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
    04 m6A RNA修飾靶基因驗證

    MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒

    云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq® MeRIP試劑盒,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
    05 機制互作研究

    5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒

    篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
    5.2 RNA pull down -MS/WB
    篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
    5.3 雙熒光素酶實驗
    驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
    5.4 ChIP-seq
    篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。

    --  云序生物服務優勢  --

    優勢一:發表10分以上文章*多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表70+篇高水平文章,合計影響因子570+,是國內支持發文*多、累計影響因子**的公司。
    優勢二:至今完成4000+例 m6A測序樣本,**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
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    優勢五:率先研發微量MeRIP測序,RNA量低至500ng起。
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