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    Nature 新發現:線粒體 m5C 修飾竟是腫瘤轉移的元兇!
    日期:2022年07月14日    來源:
    2022年6月29日,RNA m5C 修飾研究又一次登上頂尖期刊 Nature。究竟是什么原因使得 m5C 研究經久不衰,又是什么亮點使得這項研究可以脫穎而出榮登 Nature 雜志呢?讓云序生物帶您來一探究竟。
    m5C(5-甲基胞嘧啶,5-methylcytosine)是一種較為常見的 RNA 修飾類型。普通的胞嘧啶(C)在 NSUN3 等 m5C 甲基轉移酶(m5C Writer)的催化下,以 SAM (S-adenosyl-l-methionine)為甲基來源,形成 m5C 修飾。其主要測序研究方法包含基于抗體富集的 MeRIP-seq 法以及基于化學轉化的BS-seq。f5C(5-甲酰胞嘧啶, 5-formylcytosine )是在 m5C 修飾的基礎上進一步氧化得到的產物,該過程由 ALKBH1 酶催化。f5C 在早前的研究中見諸哺乳動物線粒體的 tRNA 當中。最近,德國癌癥研究中心等機構的研究者在 Nature 雜志上發文揭示了線粒體 tRNA 中特定位點上的 m5C 和 f5C 修飾對線粒體能量代謝的調控作用,進而促進**的轉移。該發現為癌癥治療提供了一條基于抑制線粒體 m5C 修飾的新思路。
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    發表期刊:Nature
    論文標題Mitochondrial RNA modifications shape metabolic plasticity in metastasis
    相關方法tRNA m5C BS-seq
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    圖 tRNA 第34位 m5C 和 f5C 修飾示意圖

    線粒體 tRNAMet 上的 m5C 和 f5C 修飾
    研究者在重亞硫酸鹽測序(BS-seq, bisulfite sequencing)的基礎上進行了改進,實現了對 m5C 和 f5C 兩種 RNA 修飾同時進行單堿基分辨率的檢測。作者使用該方法對多種*細胞進行了測序,測序結果顯示,tRNAMet 上的第34位堿基是所有線粒體 tRNA 中**一個可以發生 f5C 修飾的位點,而該位點恰好位于 tRNA 反密碼子環上的反密碼子第3位,即搖擺位(wobble position)。將同時檢測 m5C 和 f5C 的測序結果與*檢測 m5C 的 BS-seq 測序結果進行比對,研究者發現,對于實驗中所用的所種*細胞, 在 tRNAMet 的第 34 位上,有超過 50% 的 m5C 修飾,以及約 35% 的 f5C 修飾。若在*細胞中敲降 m5C Writer 基因 NSUN3,則在 tRNAMet 的第 34 位上 m5C 和 f5C 兩種修飾的比例都**降低。以上證據說明,人類*細胞當中 tRNAMet 的第 34 位上的 m5C 和 f5C 修飾依賴于 NSUN3 酶的存在。
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    線粒體 m5C 修飾對**轉移不可或缺

    通過在小鼠體內進行*細胞的原位移植實驗,研究者發現,雖然缺失 NSUN3 酶的細胞移植仍然能造成**的發生和生長,但卻無法造成**轉移(Metastasis)。因此,作者認為線粒體 tRNAMet 第34位上的修飾對于**轉移是不可或缺的。

    m5C 修飾調控線粒體功能
    在敲降了 NSUN5 的*細胞中,研究者通過 OP-puro 實驗檢測了新生肽鏈的翻譯效率,發現 NSUN5 敲降導致的低甲基化阻礙了線粒體蛋白的翻譯。研究者對 NSUN5 敲降的細胞進行了質譜分析,發現三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle, TCA)中的代謝產物減少。NSUN5 敲降細胞中的線粒體形態亦發生變化,外形變得更圓,且單個線粒體內的嵴數減少。因此,作者認為*細胞線粒體 tRNAMet 上的 m5C 和 f5C 修飾起到了細胞能量感應器的作用。
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    缺失m5C和f5C的**組織偏好糖酵解

    研究者在缺失 NSUN3 酶的原生**組織當中進行免疫組化實驗發現,GLU1(glucose transporter 1,葡萄糖轉運蛋白-1)的 RNA 和蛋白質水平均發生下調。在對照組織與缺失 NSUN3 酶的原生**組織之間,差異基因主要集中于線粒體能量代謝相關的基因,例如 NADH 脫氫酶、氧化還原酶以及電子傳遞鏈相關的基因。針對這些差異基因所的 GO 分析顯示,富集程度靠前的條目多與線粒體以及核糖體相關。GSEA 分析結果亦顯示,氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)相關的基因集的富集程度在確實 NSUN3 酶的組織中下調。研究者還在多種*細胞中檢測了 ATP 的消耗組成情況,發現 NSUN3 敲降將會提升糖酵解來源的 ATP 比例、降低氧化磷酸化來源的 ATP 比例。
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    線粒體m5C修飾促進**侵襲
    作者進一步在 3D 培養系統中對**組織進行培養,并使用特殊染料 MitoTracker CMXROS 來標記線粒體膜電勢(Mitochondrial Membrane Potential, MMP)。結果顯示,**小體(Tumoroids)表層的細胞擁有較高的 MMP,但在 NSUN3 敲降的**小體中,表面這層 MMP 值高的細胞消失了,暗示著 NSUN3 的缺失可能限制了**表層細胞通過氧化磷酸化獲取能量,進而局限了**侵襲的能力。研究者在 3D 膠原蛋白矩陣中測試了**小體的侵襲能力,發現侵襲先導細胞(Invading leader cells)具有較高的 MMP 以及較長的線粒體,且 NSUN3 酶的缺失將會減少單個**小體所產生的先導細胞個數。因此,作者認為線粒體內 tRNAMet 上的第34位 m5C 修飾可以促進**侵襲。
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    m5C通過CD36驅動的**轉移
    早前的報道顯示,在人類口腔*中,有一類**細胞同時表達 CD44 和 CD36 蛋白。由于 CD36 是一類位于線粒體外膜上的蛋白,引發了作者的研究興趣。作者分選了 CD44 高表達且 CD36 也高表達的**細胞,并在此基礎上再分選出 MMP 值*高的亞群,記作“CD44HCD36H”細胞。敲降 NSUN3 會降低 CD44 和 CD36 的 mRNA 水平,使得CD44HCD36H 細胞下降了三倍之多。研究者進一步在小鼠體內進行*細胞的原位移植實驗,在小鼠的淋巴結里檢出了轉移的 CD44HCD36H 細胞。綜上所述,作者認為線粒體中的 m5C 修飾可通過 CD36 驅動**的轉移。
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    CD44HCD36H 先導轉移細胞的蛋白質組學特征
    研究者對 CD44HCD36H 先導轉移細胞進行了定量蛋白組學實驗,并對檢測到的蛋白進行了無監督聚類,其中第3類細胞與 CD44 和 CD 36 的表達量表現出*強的正相關關系。針對聚類結果中的第3類蛋白進行 GO 分析,排名在前的條目多與線粒體活動相關。作者還在缺失 NSUN3 酶的*細胞中過表達 CD36,發現 CD36 的過表達并不足以使得氧代謝率回升,亦不足以促進**小體的生長??傊?,CD36 信號雖可以促進**轉移,但仍需要 NSUN5 的正常表達作為前提條件。

    代謝重編程是動態可逆的
    在 NSUN3 敲降的*細胞中,作者持續檢測了 CD44HCD36H 細胞的數目。在敲降實驗后的前 6 天,CD44HCD36H 細胞數目持續下降,但活細胞的總數并不下降。這說明 NSUN3 酶確實只影響細胞的轉移能力,但不影響細胞的生長或死亡。

    NSUN3基因在**中的作用
    作者對 78 份頭頸鱗*(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)**組織進行 NSUN3 免疫組織染色以及 qPCR 定量,發現 NSUN3 水平與原發**的更高病理分期相關。作者在 TCGA 公開數據中分析了 500 份頭頸鱗*的數據,根據 NSUN3 驅動表達的基因可以在無監督聚類后將患者分為四組,其病理分期和診斷時淋巴結轉移現象的存在隨著 NSUN3 水平逐漸增加。組織免疫染色結果顯示,NSUN3蛋白水平在**侵襲的前緣*高。因此,作者認為 NSUN3 的活性在接近**-基質邊界*高,并在那里**侵襲發生。
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    線粒體調節**轉移
    由于線粒體的蛋白翻譯機制與原核生物存在相似性,作者希望可以通過使用***來減弱線粒體的蛋白翻譯,模擬 NSUN3 缺失所造成的對**細胞轉移的抑制作用。研究者將多種**細胞暴露于***環境并檢測其侵襲能力。CAP(氯霉素)、LIN(利奈唑胺)、TIG(加環素) 和 DOX (多西環素)這幾類***可以減少**小體當中先導細胞的數量,并減少葡萄糖的攝取,CD44HCD36H 細胞的數目也減少約兩倍,但細胞活力并不受這些***處理的影響。*后,研究者還在小鼠體內驗證了*****的效果,證明抑制線粒體翻譯可以造成與 NSUN3 酶敲降類似的效果,阻止**細胞的轉移。
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    小  結
    作者通過對**細胞線粒體中的 tRNAMet 的 RNA 修飾測序,發現了第 34 位上特異的 m5C 和 f5C 現象,并將這一位點的修飾現象與**細胞的轉移能力關聯起來。作者認為,抑制線粒體中的 m5C 的形成,可以作為阻止原發**轉移的一個**切入點。
    時至**,仍然有許多類型的生物樣品尚未被開展過 m5C 修飾的研究,更缺乏對單個 m5C 修飾位點的生物學功能的認識。m5C 修飾的功能研究,尚有大量空白等待您去填補。


    云序生物m5C甲基化研究五大模塊
    01 m5C RNA甲基化測序
    m5C RNA甲基化測序(m5C-seq)
    對m5C RNA甲基化,目前*流行的檢測手段為m5C-Seq技術,適用于m5C RNA甲基化譜研究,快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序:
    • m5C 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
    • m5C  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
    • m5C  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
    • m5C  mRNA測序

    02檢測整體m5C RNA甲基化水平
    LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平
    **高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。

    03 m5C RNA甲基化上游酶的篩選
    m5C RNA甲基化相關酶PCR芯片
    尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。

    04 m5C RNA甲基化靶基因驗證
    meRIP-qPCR
    云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

    05 機制互作研究
    5.1 RIP-seq/qPCR
    篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
    5.2 RNA pull down -MS/WB
    篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
    5.3 雙熒光素酶實驗
    驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。

    --  云序生物服務優勢  --
    優勢一:云序累計支持客戶發表220+篇SCI論文,合計影響因子1900分+
    優勢二:至今完成數千例RNA甲基化測序樣本,**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
    優勢三:**檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
    優勢四:**提供m5C一站式服務:m5C整體水平檢測、m5C-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull-down等。
    優勢五:率先研發微量MeRIP測序技術,RNA量低至500ng起。
    優勢六:提供多種RNA修飾測序服務,包含m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。

    云序客戶m5C修飾部分文章列表


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