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    客戶文章|m6A甲基化測序助力膿毒癥誘導的ARDS表位機制研究
    日期:2022年08月15日    來源:
    m6A修飾在膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)中的具體作用尚不清楚。2022年5月25日,云序客戶上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院俞衛鋒課題組在Front Immunol雜志上發表文章“METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modifification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome”該文章發現METTL3是參與m6A RNA修飾缺失的主要調控因子,能通過trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷。云序生物有幸參與了此項研究中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq等高通量技術服務。
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    發表期刊:Front Immunol
    發表日期:2022年5月25日
    影響因子:8.786
    研究方法RNA-seq、m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、ELISA比色法
    樣品類型:細胞
    文章鏈接METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome


    技術路線

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    研究內容



    01  膿毒癥誘導的ARDS中m6A修飾的失調
    為了闡明m6A修飾在隔膜誘導的ARDS中的功能作用,文章首先通過ELISA比色法評估了健康小鼠肺組織和膿毒癥小鼠肺組織中的RNA m6A整體水平,發現膿毒癥肺中總RNA中的m6A水平**降低(圖1. A)。比較肺組織和肺微血管內皮細胞(PMVECs)中writers(METTL3、METTL8、METTL14和WTAP)和erasers(ALKBH5和FTO)的mRNA m6A水平,發現甲基轉移酶METTL3和METTL14在膿毒癥肺和LPS刺激的PMVECs中**下調,其他基因的表達無**差異(圖1. B-C)。通過免疫印跡法檢測,METTL3在膿毒性肺組織和LPS處理的PMVECs中的蛋白表達也**低于正常肺組織(圖1. D-E)。免疫組織化學法結果表明,與正常肺組織相比,膿毒癥肺組織中METTL3的表達明顯降低(圖1. F)。表明膿毒癥的發生可能與m6A甲基轉移酶METTL3的失調有關。
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    圖1 膿毒癥誘導的ARDS中METTL3-m6A通路下調


    02  METTL3與膿毒癥誘導ARDS中異常m6A修飾相關
    為了確定METTL3在膿毒癥誘導的ARDS中的作用,文章構建了METTL3敲低模型,研究了METTL3對膿毒癥誘導的肺損傷的影響。假手術組小鼠的組織學檢查顯示肺正常,肺泡壁薄,偶有肺泡巨噬細胞,中性粒細胞少。METTL3 siRNA-CLP中的小鼠與NC siRNA-CLP組相比,該組的中性粒細胞浸潤、出血、透明膜形成和肺泡壁增厚明顯增加(圖2. A),結果與肺損傷評分結果一致,并表明METTL3缺失**加重了膿毒癥誘導的肺損傷(圖2. B)。與NC siRNA相比,METTL3 siRNA**后支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的細胞計數、蛋白和促炎細胞因子表達水平**升高(圖2. C-D)。文章還檢測了MPO的活性來評估肺組織中中性粒細胞的積累,METTL3下調**提高了膿毒癥小鼠的MPO活性(圖2. E)。通過Evans blue組織分散度評估,METTL3基因敲除的小鼠顯示血管滲漏增加(圖2. F),此外,對循環血液中測量了一組炎癥標志物,結果表明,在檢測的40種炎癥標志物中,有12種比NC siRNA-CLP組中增加了至少2倍(圖2. G)。siMETTL3處理導致CLP誘導的動物死亡**增加,小鼠在72小時后沒有存活(圖2. H)。這些數據表明,METTL3的敲低加重了內皮屏障完整性的損傷和膿毒癥引起的炎癥反應。
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    圖2 METTL3缺失加重了CLP模型中的肺內皮損傷


    03  METTL3在體外調節血管內皮屏障功能
    由于METTL3在膿毒癥肺中的表達**下調,文章進一步研究了METTL3在內皮屏障維持中的關鍵作用。在不同的時間點用LPS刺激細胞。測量經上皮電阻(TEER)來評估屏障功能。METTL3的下調在6h時導致了單層抗性的**降低,并持續了至少24h(圖3. A),表明METTL3的下調**增加了HULEC-5a細胞的通透性。此外,文章還發現用METTL3 shRNA處理HULEC-5a細胞時,血管鈣粘蛋白發生連接丟失和細胞間黏附分子-1積累(圖3. C),表明抑制METTL3會破壞內皮細胞通透性,加重內皮屏障功能障礙。與shRNA對照組相比,METTL3下調導致的炎癥因子表達升高(圖3. E)。而METTL3過表達能**改善內皮細胞的單層抗性(圖3. B),并提高了ve-鈣粘蛋白連接的表達(圖3. D),炎癥反應被有效抑制(圖3. F)。結果表明,METTL3在血管間隔誘導的肺損傷中調節血管內皮屏障功能中起著關鍵作用。
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    圖3 METTL3在體外調節血管內皮屏障功能


    04  METTL3介導的m6A的Trim59 mRNA修飾維持其YTHDF1依賴的穩定性
    為了確定METTL3調控內皮屏障功能的分子機制,文章對兩組HULEC-5a細胞進行了RNA-seqm6A MeRIP-seq檢測。m6A MeRIP-seq結果顯示,1011個轉錄本中的m6A峰豐度下降(圖4. A)。通過RNA-seq、m6A MeRIP-seq結果和GO分析,文章選擇了5個與免疫應答調節和細胞粘附相關的5個基因(Tanc2、Trim59、Dhx33、Map3k13和Map3k20),驗證了在METTL3敲低的HULEC-5a細胞中這5個候選基因的mRNA水平。在HULEC-5a細胞中,只有Trim59被METTL3持續下調。m6A測序在對照組和m6A敲低組中分別鑒定出32757和33227個m6A峰(圖4. B)。當m6A甲基化組被定位時,確定了m6A共有基序GGAC(圖4. C)。與對照組相比,經shMETTL3處理的HULEC-5a細胞中,Trim59mRNA外顯子周圍的m6A峰的大小**減小(圖4. D)。m6A MeRIP-seq驗證結果表明,與shRNA對照組相比,m6A特異性抗體**降低了METTL3敲低誘導的Trim59mRNA的富集(圖4. E)。并且敲除METTL3基因可以縮短Trim59的半衰期(圖4. F)。RIP結果發現,YTHDF1在Trim59mRNA中明顯富集于YTHDF2,而不是YTHDF2和YTHDF3,這表明YTHDF1與Trim59mRNA之間存在相互作用(圖4. G)。YTHDF1沉默降低了LPS誘導的HULEC-5a細胞中Trim59的表達(圖4. H)。METTL3介導的m6A修飾通過YTHDF1依賴的Trim59mRNA的穩定性維持了Trim59的表達。
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    圖4 METTL3介導的Trim59mRNA的m6A修飾維持了其YTHDF1依賴的穩定性


    05  METTL3通過靶向Trim59調節內皮功能
    為了進一步確定METTL3是否通過靶向Trim59調控內皮功能,文章將Trim59 siRNA共轉染到過表達METTL3的HULEC-5a細胞中(圖5. A-B)。經內皮電阻(TEER)結果顯示,在METTL3過表達的細胞中,敲除Trim59,部分逆轉了METTL3對脂多糖誘導的內皮損傷的保護作用(圖5. C)。當Trim59表達下調時,METTL3過表達介導的內皮屏障恢復被**抑制(圖5. D)。此外,Trim59的敲除加劇了內皮細胞的炎癥反應(圖5. E)。表明METTL3通過部分調節Trim59的表達來改善LPS誘導的血管內皮損傷。
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    圖5 METTL3通過靶向Trim59調節內皮功能


    06  METTL3通過Trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷
    為了確定METTL3介導的內皮損傷抑制是否參與了Trim59的調控,文章評估了METTL3對NF-kB通路因子表達的影響。METTL3過表達通過降低p65磷酸化**抑制NF-kB通路(圖6. A),特異性NF-kB信號抑制劑BAY抑制p65磷酸化則降低METTL3誘導的內皮損傷標志物的表達(圖6. B)。Trim59的下調**促進了NF-kB通路的**(圖6. C)。這些數據表明,METTL3通過trim59相關的NF-kB失活調節膿毒癥誘導的ARDS的內皮功能。
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    圖6 METTL3通過trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷


    總   結

    該篇文章通過RNA-seq和 m6A MeRIP-seq分析發現,Trim59是TRIM家族的一個成員,是HULEC-5a細胞中METTL3敲除時被抑制的基因。文章發現METTL3介導的m6 A修飾在膿毒癥肺中被調節異常,證實了m6A修飾在膿毒癥誘導的ARDS中的一種新功能。研究還顯示了METTL3在調節血管內皮屏障功能中的關鍵作用。此外,在機制上,METTL3通過trim59相關的NF-kB失活來抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷。該文章為膿毒癥相關ARDS的新**策略的發展提供了見解,并揭示了這種修飾在膿毒癥相關肺損傷的診斷、預后和分子靶向**中的應用價值。

    云序生物m6A修飾研究五大模塊

    01 m6A RNA修飾測序

    m6A RNA修飾測序(m6A-meRIP-seq)

    對m6A RNA甲基化,目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術,適用m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:

    • m6A 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
    • m6A  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
    • m6A  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
    • m6A  mRNA測序
    • m6A  miRNA測序


    02 檢測整體m6A RNA修飾水平

    LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平

    **高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。

    比色法檢測整體RNA修飾水平

    快速檢測m6A整體甲基化水平

    03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

    m6A RNA修飾相關酶PCR芯片

    尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。


    04 m6A RNA修飾靶基因驗證

    MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒

    云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq® MeRIP試劑盒,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。


    05 機制互作研究

    5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒

    篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。

    5.2 RNA pull down -MS/WB

    篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。

    5.3 雙熒光素酶實驗

    驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。

    5.4 ChIP-seq

    篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。



    --  云序生物服務優勢  --

    優勢一:云序累計支持客戶發表  83  +篇RNA修飾SCI論文,合計影響因子 795  +
    優勢二:累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本,**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
    優勢三:**檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
    優勢四:**提供m6A一站式服務:m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull-down等。
    優勢五:率先研發微量MeRIP測序技術,RNA量低至500ng起。
    優勢六:國內*全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。


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