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    表觀遺傳學研究
    6mA DNA甲基化測序
    日期:2019年07月15日    來源:

    技術簡介
    DNA甲基化修飾是表觀遺傳研究的熱點之一,我們通常認為DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine, 5mC),卻不知道隨著測序技術的快速發展,一種新的DNA甲基化修飾類型—DNA-6mA甲基化已經成為表觀遺傳學領域的研究熱點。 

    云序生物率先開發了DNA-6mA測序技術—6mA-IP-seq。其原理類似于MeDIP的免疫共沉淀測序技術,利用特異性抗體富集6mA片段,擴增后進行高通量測序及甲基化分析,以較小的數據量,快速地繪制全基因組DNA甲基化水平的圖譜。

     技術優勢

    一站式服務:

    客戶只需提供相關樣品的基因組DNA,云序生物為您完成從6mA-IP富集,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程

    優化的實驗流程:

    6mA-IP的富集效率是決定數據質量的關鍵,云序生物6mA-IP實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程,具有極高的效率和特異性

    嚴格的質控:

    實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控,全程監控實驗質量,確??蛻舻玫絻?質的數據

    專業的生物信息學分析:

    云序生物具有強大的生物信息學團隊,能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求

    樣本要求

    樣品類型:無降解且無RNA污染的DNA樣品(適用全部有參考基因組的物種)。

    樣品需求量:不少于10ug

    樣品濃度:不少于50ng/ul

    樣品運輸及保存:

    樣品運輸:樣品置于1.5mL Eppendorf 管中,封口膜封好,干冰運輸,DNA可用冰袋運輸。

    樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊切塊,液氮凍存后-80℃保存;DNA樣品短期內可-20℃,避免反復凍融。

    數據分析

    1、DNA甲基化富集峰的識別

    通過高通量測序和生物信息分析,識別甲基化富集的基因組區域,默認p <= 1e-5(具體參數以報告為準,云序生物會根據數據,適當調整參數)的峰為統計上明顯的甲基化區

    注:每個樣品組做一個Input,以去除基因組背景,降低假陽性率

    DNA甲基化富集峰的識別

    2、DNA甲基化區域富集峰的注釋 

    富集峰識別后,得到的是一堆基因組位置信息,通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰


    DNA甲基化區域富集峰的注釋  

    3、DNA甲基化富集峰區域的在基因中的分布


    DNA甲基化富集峰區域的在基因中的分布         DNA甲基化富集峰區域的在基因中的分布


    4、差異DNA甲基化區域的鑒定(DMRs)與注釋 

    云序生物使用diffReps軟件進行差異甲基化區(differentially methylated regions,DMRs)鑒定。默認p-value<0.0001,fold change >=2作為差異甲基化區的閾值

    差異DNA甲基化區域的鑒定(DMRs)與注釋  

    5、差異DNA甲基化區的GO(Gene Ontology)與信號通路分析

    目的:對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目


    差異DNA甲基化區的GO(Gene Ontology)與信號通路分析          差異DNA甲基化區的GO(Gene Ontology)與信號通路分析

    6、DNA甲基化可視化


     DNA甲基化可視化


    案例分析:

    DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.

    期刊:Nature,影響因子:44.958

    作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三種技術相結合的方法研究小鼠基因組甲基化。研究發現小鼠胚胎干細胞中存在另一種DNA甲基化修飾—6mA甲基化;Alkbh1是腺嘌呤甲基化修飾的一種去甲基化酶,在Alkbh1基因缺失突變小鼠細胞中腺嘌呤甲基化水平增加,進而導致轉錄沉默。揭示了哺乳動物表觀修飾的重要組成部分—6mA甲基化,在哺乳動物中發揮沉默基因表達的功能,而不是如其他生物體中激 活基因表達的作用。

    6mA分析      6mA與基因表達的關系

                          6mA分析                                           6mA與基因表達的關系

    6mA-IP seq分析

    6mA-IP seq分析

    N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.

    期刊:Cell, 影響因子:31.398

    作者以果蠅胚胎干細胞為材料,對其基因組中6mA修飾進行研究,發現在果蠅基因組中6mA修飾存在,這種修飾受內源去甲基化酶DMAD調控,在胚胎發育過程中呈動態變化。進一步研究發現,DMAD酶作為果蠅胚胎發育所必須的一種酶,它作用于轉座子的6mA位點,去甲基化后,轉座子的表達受到抑制。該文章發現果蠅中DNA甲基化修飾新類型-6mA,并且初步探究了6mA甲基化的調控機制。

    6mA分布   mA體外去甲基化分析

         6mA分布                                       mA體外去甲基化分析

    6mA-IP seq與RNA-seq聯合分析6mA-IP seq與RNA-seq聯合分析

    6mA-IP seq與RNA-seq聯合分析

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