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    表觀遺傳學研究
    核糖體印跡測序
    日期:2021年02月23日    來源:
    技術簡介
    核糖體印跡測序又稱Ribosome profiling,或Ribo-seq,是運用測序手段研究翻譯組學的一種主要的技術手段。該技術通過使用翻譯抑制劑使正在翻譯的mRNA序列固定在核糖體上。加入核酸酶處理不受核糖體保護的mRNA,分離核糖體并提取純化核糖體上未被消化的短片段mRNA(大約30nt),進而獲得正在翻譯的mRNA序列。這項技術可獲得實時全轉錄組正在翻譯的序列信息,使研究者能從分子水平檢測蛋白組的翻譯情況,并了解蛋白質的翻譯水平及翻譯過程,在蛋白翻譯機制的研究領域中有廣闊的應用前景。
    云序生物對mRNA翻譯進行研究的技術是利用Ribo-seq測序技術,其原理為:利用翻譯抑制劑處理細胞或組織,首先經過核酸酶消化游離mRNA,然后富集核糖體-mRNA復合物,得到RPFs。去除rRNA并用PAGE膠純化后,得到目的RNA片段。建庫測序及數據分析,從而得到相應樣品的蛋白翻譯水平。

    核糖體印跡測序


    云序優勢

    一站式服務: 
    客戶只需提供細胞、組織或RNA,云序生物為您完成從樣本富集,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。 
    優化的實驗流程: 
    RPFs的富集效率是決定數據質量的關鍵,云序生物Ribo-seq實驗采用精心優化的實驗流程,具有極高的效率和特異性。 
    嚴格的質控: 
    云序生物對Ribo-seq實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控,全程監控實驗質量,確??蛻舻玫絻炠|的數據。 
    專業的生物信息學分析: 

    云序生物具有強大的生物信息學團隊,能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。 


    樣本要求
    樣品類型:
    動物組織,植物組織,細胞,菌類以及客戶分離的 RPF(核糖體復合物),其它類型樣品請詳詢。
    樣品量:

    a)細胞:1×107,細胞活性 90%以上
    b)動物組織:≥300mg
    c)植物組織:≥300mg
    d)RPF :≥200ng/ul,10ul 以上 
    其它類型樣品用量請詳詢。

    樣品的運輸與保存:

    在簡單處理并標記后,-80℃冰箱保存,以避免實驗操作前樣品降解的可能性。 干冰運輸。


    數據分析
    1. Ribo-seq表達量分析
    通過高通量測序及生信分析,獲得Ribo-seq表達量密度分布圖。
    通過高通量測序及生信分析,獲得Ribo-seq表達量密度分布圖。
    2. Ribo-seq樣品間相關性分析
    樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是合理的重要指標。相關系數越接近1,表明樣品之間表達模式的相似度越高。
    樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是合理的重要指標。相關系數越接近1,表明樣品之間表達模式的相似度越高。
    3.uORF序列分析
    分別對untranslated uORF和Translated uORF進行motif分析;分析其序列偏好性,可以用于基因翻譯調控元件的分析。
    分別對untranslated uORF和Translated uORF進行motif分析;分析其序列偏好性,可以用于基因翻譯調控元件的分析。

    4. P-site分析
    翻譯過程中,核糖體相對于RNA以密碼子長度(3 nt)為單位移動。因此,以 P - 位點為基準,來源于正常翻譯過程的RPF 片段應該在 RNA 上呈現 3 堿基的周期性分布。這是判斷一個 RNA 是否被翻譯的直接證據。

    4.P-site分析


    案例分析

    案例1:特異性tRNAs的表達調控驅動基因表達和癌癥進展
    原文:Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression
    期刊: Cell (2016) 影響因子:36.216
    作者通過在5種細胞系中進行tRNA測序研究和Ribo-seq研究發現,在人類乳腺癌中特異性tRNAs:tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG表達上調,可使癌細胞獲得轉移能力。研究者通過Ribo-seq檢測這些特殊tRNAs增多后轉錄本上的核糖體結合情況,結果顯示富集這些tRNA同源密碼子的轉錄本更加穩定,核糖體結合更多。特別是tRNAGluUUC通過直接增強EXOSC2表達與增強GRIPAP1來構成一條受tRNA驅使的“可誘導”通路,從而促進癌癥轉移。 因此,該研究說明tRNA是基因表達的動態調節因子,RNA調節是細胞實現特定轉錄物和蛋白質表達改變的一種機制。
    tRNAs的表達調控基因表達和癌癥進程
    tRNAs的表達調控基因表達和癌癥進程

    案例2:人心臟的翻譯組學研究
    原文: The Translational Landscape of the Human Heart
    發表期刊: Cell (2019) 影響因子:36.216
    基因在人體組織中的表達的研究主要集中在轉錄水平上,而翻譯調控常被忽視。本研究對65例擴張性心肌?。―CM)患者左心室心肌組織和15例正常對照組的左心室心肌組織進行mRNA測序(mRNA-seq)和核糖體印跡測序(Ribo-seq),分析了DCM與健康對照組中RNA分子翻譯效率的總體情況,結合先前研究的心臟組織蛋白質組學的數據,系統分析了左心室心肌組織中被翻譯的ORF以及對應的蛋白或多肽的總體信息。分析后發現在1090個uORF、 22335個傳統的ORF還包括了來自于169個lncRNA 的339個sORF。本文通過分析Ribo-seq數據鑒定出了169個lncRNA和40種環狀RNA (circRNAs)編碼的新的微蛋白,這表明這些微蛋白在人體中的生物學功能尚未被發現。而本研究中的這一發現可能為研究其他人類組織翻譯組學提供依據。
    心臟翻譯組學研究概覽
    心臟翻譯組學研究概覽


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