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    表觀遺傳學研究
    ctDNA EM-seq 甲基化測序
    日期:2022年03月18日    來源:


    ctDNA EM-seq 甲基化測序

    cfDNACell free DNA)是人體組織排放到血液、尿液或腦脊液等循環體系中的降解的DNA小片段,是一種新型的分子標記物。ctDNACirculating tumor DNA)特指來源于腫瘤細胞的cfDNA,是液體活檢主流方向。報道表明:ctDNA 5mC 甲基化 5hmC 羥甲基化不僅可以作為腫瘤分子標志物,還可用于追溯腫瘤細胞的組織來源。在醫療大趨勢下,ctDNA甲基化檢測既具有極高的科研價值,又具備推進醫療臨床實踐的巨大潛能,為實現腫瘤臨床治療的全病程管理提供強有力的支持。利用ctDNA甲基化測序,僅憑一管液體就可以進行腫瘤診斷、療效評估、實時監控、個體化用藥、預測復發等,是里程碑式的新型液體活檢技術。

    針對血液樣品中的 ctDNA 進行優化,云序生物為您帶來一種基于酶學方法的 DNA 甲基化測序技術 EM-seqEnzymatic Methyl-seq。該方法結合使用多種酶,在保證 5mC 5hmC Illumina 測序中仍被識別為 C 的前提條件下,將未發生修飾的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),并在后續的擴增和測序過程中被識別為胸腺嘧啶(T)。EM-seq 有效彌補了全基因組重亞硫酸鹽法測序(WGBS需要極端反應條件的缺陷,可以廣泛應用于包含 ctDNA 在內的微量脆弱 DNA 樣品。同時,EM-seq 得到的測序結果與 WGBS 得到的轉化序列相同,因此可以使用相同的數據分析流程。運用 EM-seq 技術,僅需低至 10 ng DNA 樣品便可進行單堿基精度的全基因組 5mC 修飾測序。

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    EM-seq 的優勢相比于傳統的WGBS 擁有多種優勢

    1、 DNA 測序文庫質量高、所需 DNA 起始量小

    相比于WGBS,EM-seq DNA 的損傷小,因此可以用更少 DNA 樣品、更少的 PCR 輪數擴增出高質量的測序文庫。云序生物提供的 EM-seq 服務,所需的 DNA 起始量可低至10ng。 

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    2、DNA 文庫的插入片段更長、更完整

    相比于WGBS,EM-seq 處理后的 DNA 片段更完整,長度更長,避免產生測序缺口。

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    3、出色的 GC 覆蓋均一性

    無論 GC 程度高低,EM-seq 的覆蓋度都有均勻且優良的表現;相比之下,WGBS 測序文庫高估了 AT 區,卻低估了 GC 區,造成“GC 覆蓋度偏誤。

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    4、均一的雙核苷酸分布

    由于“GC 覆蓋度偏誤的存在,在連續雙核苷酸的檢出效率方面,WGBS 對于不同的雙核苷酸存在較嚴重的偏誤,而 EM-seq 則能展示出均一的覆蓋情況。

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    5、更強的匹配率和更低的重復率

    相比于 WGBS,EM-seq 測序結果與參考基因組的匹配率更高,同時重復率更低。

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    6、用更少的測序出更多的 CpG

    同等測序覆蓋深度的情形下,EM-seq 所發現的 CpG 數目要遠多于 WGBS,在這其中有很大比例的 CpG 位點是僅僅只能能用 EM-seq 法才能檢測到的。

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    7、多次實驗之間的一致性更高

    EM-seq 文庫在不同起始量之間的相關性都很高,表明 EM-seq 檢出的數據具有很好的可重復性,且甲基化檢測靈敏度不會隨著起始量的減少而降低;相形之下,不同的 WGBS 文庫之間的相關性就不夠理想。

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    8、更精準地檢測轉錄起始位點的甲基化數據

    在低表達基因的轉錄起始位點附近,胞嘧啶一般會發生甲基化修飾,但由于 WGBS 法傾向于低估 GC 區域,因此難免遺漏一些轉錄起始位點附近的甲基化修飾;EM-seq 因為其出色的 GC 覆蓋均一性,可以更精準地檢測轉錄起始位點的甲基化數據。 

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    樣品要求

    1)樣品類型:腫瘤患者的血漿、血清或 cfDNA。

    血漿和血清相比較而言,推薦使用血漿,以減少淋巴細胞來源的 cfDNA 干擾。

    2)樣品量:血漿>5mL;血清>10mL;cfDNA>10 ng。

    3)血漿提?。?/strong>

    使用 EDTA 抗凝管收集全血,切勿冷凍保存,只能在 2-8℃ 冰箱短暫存放,并盡快進行低溫離心獲取血漿。

    若不能進行低溫離心,則需要使用添加專有穩定劑的 STRECK 無創管來保存全血,可在常溫條件下離心。

    為了最大程度消除殘留的細胞,血漿需要進行二次離心:第一次在 4℃ 條件下以 1600g 離心 10 分鐘;第二次在 4℃ 條件下以 16000g 離心 10 分鐘。

    4)樣品保存:血漿、血清樣品液氮速凍后 -80℃ 冰箱保存。樣品保存期間避免反復凍融。

    5)樣品運輸:封口膜封好樣品,干冰運輸。

     

    云序生物服務優勢

    優勢一:一站式服務。客戶只需提供樣本,云序生物為您完成從ctDNA提取,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。

    優勢二:超微量ctDNA 起始量要求。云序生物可以進行低至 10 ng  ctDNA 測序。

    優勢三:測序數據真實可靠。云序生物避免了傳統 5mC 檢測方法的 GC 覆蓋度偏誤,還擁有更完整的 DNA 讀長,文庫質量更加可靠。

    優勢四:嚴格質控流程:云序生物質控流程嚴格,層層把關,為客戶提供高準確度的結果。

    優勢五:專業化生物信息分析:云序生物強大生物信息團隊,滿足客戶個性化數據分析要求。


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